前言
微分干涉对比（DIC）光学元件的正确调整和对准对于成像性能至关重要，因此显微镜学家必须识别错位和元件不匹配，并采取必要步骤纠正这些误差。本交互式教程在各种配置基序下检查DIC显微镜中的锥光和正射视场，并讨论推荐用于令人满意的显微镜对准的许多重要方面。
教程说明
本教程使用置于锥光观察模式的虚拟DIC显微镜（模拟虚拟相位望远镜或Bertrand透镜）进行初始化，并且仅将偏振器和分析仪（透射轴交叉）插入光路。此外，在初始化时，聚光镜隔膜已关闭到其最宽孔径尺寸的80%。要操作本教程，请首先从位于视口左侧的成像模式单选按钮集中选择 DIC 技术，即Nomarski或de Sénarmont。接下来，从物镜放大倍率下拉菜单中选择一个物镜（默认值为10倍）。请注意，当选择新物镜时，在显微镜视口中观察到的聚光镜孔径光阑的尺寸会成比例地增加或减小。使用“聚光圈”光圈滑块更改光圈的开口大小。
要在光学系中安装Nomarski棱镜，请使用物镜或聚光镜单选按钮。当选择其中一个单选按钮时，视口将显示单个Nomarski棱镜的锥光图像，该棱镜的大小根据物镜选择而变化。如果选择了物镜，滑块将更改为显示文本：当显微镜处于Nomarski模式时为客观棱镜平移，或当显微镜处于de Sénarmont模式时显示偏振片方向。如果选择了聚光镜棱镜，则当显微镜处于de Sénarmont模式时，将显示偏振器方向文本，但当显微镜处于Nomarski模式时，滑块将被停用。
在Nomarski或de Sénarmont成像模式下，滑块可用于改变引入光学序列的偏置延迟。在Nomarski模式下（仅当选择了“物镜”时），“物镜平移”滑块最初位于中心位置，不添加任何偏差。将滑块向右平移会引入负偏置，而将滑块移到中间的左侧会产生正偏置。本教程在de Sénarmont模式下以相同的方式运行，只是可以选择任一棱镜，并且偏振器方向滑块还指示偏振片从中心位置旋转的度数。
要将两个棱镜（聚光镜和物镜）添加到虚拟DIC显微镜光学序列中，请在Nomarski或de Sénarmont成像模式下选择两个棱镜单选按钮。然后可以使用客观棱镜平移（Nomarski模式）或偏振器方向（de Sénarmont模式）滑块调整偏差。为了向光路添加一阶补偿板，请在补偿器复选框中打勾。在上述所有情况下，都可以通过选择正射单选按钮将虚拟DIC显微镜置于正射模式。然后，视口将显示当虚拟Bertrand镜头从光路中移除时场的显示方式。
微分干涉对比显微镜对准
在尝试配置显微镜以微分干涉对比进行观察之前，请检查仪器以确定是否存在所有必要的组件，并且没有绒毛、灰尘和碎屑。包含应力特征的物镜和聚光镜元件会降低DIC中的图像质量，光学通道中的脏透镜表面、划痕和污染异物也会降低质量。显微镜的正确对准对于获得最佳结果和产生显示伪三维和阴影投射效果的图像至关重要。以下程序中概述的许多步骤仅在首次将显微镜对准DIC时才需要，并且不需要重复进行日常观察。每次使用显微镜进行DIC检查时，应采取其他步骤。
初步显微镜检查 - 仔细检查显微镜，以确保已安装所有必要的DIC组件，或在必要时可用并准备使用。拆下冷凝器，拆卸转塔，并检查诺马斯基或沃拉斯顿棱镜的状况。这些复合棱镜的表面应清洁，没有灰尘和碎屑。由于DIC聚光镜棱镜位于冷凝器转塔内，因此很少被指纹污染，但灰尘和棉绒很容易流入转塔并落在其中一个平坦的石英表面上。要清洁受污染的棱镜表面，请使用橡胶气球去除松散的纤维和灰尘，和/或用镜片纸巾或湿软棉轻轻擦拭表面。小心不要划伤表面。物镜、聚光镜和物镜外部透镜元件、显微镜目镜透镜以及显微镜底部视场光阑端口处（或连接到倒置显微镜的支柱）处的视场透镜应给予相同的处理。确保关键部件清洁后，重新组装显微镜，安装偏光片和分析仪，然后对准光学系统以进行科勒照明。
安装偏光片和分析仪 - 拆卸显微镜（聚光镜、DIC棱镜和至少一个物镜）后，将偏振片和分析仪分别安装在聚光镜下方和物镜上方的位置。以类似于偏振光显微镜的方式，偏振器和分析仪的位置使其透射方位角彼此成90度角（垂直）。偏振器安装在光源和聚光镜之间，传统上朝向东西方向，或者在面对显微镜时从左到右定向。在某些情况下，偏振器和分析仪的位置都是由它们在安装框架中的固定位置预先确定的，并且这些组件只能以单一方向插入显微镜光路。通常，偏振片支架上的标记指示透射方向，但有些显微镜配备了以度为单位的旋转偏振器支架。分析仪也可以用刻度旋钮旋转，和/或可能包含指示传输轴的标记。
图1-微分干涉对比度中的物镜后孔径
当偏振片和分析仪交叉时（透射轴朝向90度角），通过目镜观察时，视场显得非常暗。这种情况被称为最大灭绝。如果大量光线通过显微镜并且视场不暗（或几乎是黑色），请检查以确保偏振片和分析仪交叉。穿过偏振片后，插入聚光镜和物镜，但不要安装物镜Nomarski棱镜滑块（或固定安装座）。将聚光镜转台旋转到明场位置（缺少相板或DIC棱镜的槽）。视场应保持黑暗，但如果这些组件中的任何一个（聚光镜或物镜）包含应变的镜头元件，则可能会有一些光线通过。在继续下一步之前，从光学序列（偏振片或分析仪）中取出其中一个偏振元件。
建立科勒照明 - 在进行DIC配置之前（安装偏振片后），应使用标准科勒技术对准显微镜光学系统以进行明场标本观察。正确配置后，光源（通常是卤钨灯）的图像应通过安装在灯箱中的收集透镜或沿着显微镜框架底座内的光学序列投射到聚光镜孔径光阑平面上。同时，聚光镜系统还将场光圈的图像投射到样品共轭平面（在显微镜阶段）。灯丝居中后（大多数现代灯箱都包含预定心灯），关闭聚光镜孔径光阑，并在明场照明中将聚光镜与显微镜光轴对齐（聚光镜转盘设置为0或B位置）。使用10倍物镜将光圈聚焦在聚焦标本上，然后打开虹膜叶，直到视场的外围边缘仅可见光阑的一小部分。对所使用的每个物镜采取类似的步骤，通过调整视场和孔径光靑，确保显微镜正确配置，以便依次为每个物镜进行科勒照明。在DIC的日常观察过程中，应定期检查显微镜，以确保保持科勒照明。
检查物镜后孔径 - 将显微镜配置为科勒照明后，插入偏振片和分析仪，并使用相位望远镜或Bertrand透镜（锥光观察模式）检查物镜后焦平面。如果偏振片和分析仪正确定位，显微镜完全对准，物镜孔径中会出现暗消光交叉，如图1（a）所示。消光十字架的臂应垂直和水平定向，在孔径的四个角处出现少量光（图1（a））。交叉或高双折射区域的亮点会影响消光交叉的完整性，是光学元件应变的指标。此外，在物镜后孔径下观察时，位于共轭孔径焦平面（聚光镜或物镜）附近的灰尘和棉绒颗粒会显得明亮。如果存在双折射光斑，请检查另一个无应变物镜，以确定第一个物镜或聚光镜系统是否应变。在继续下一步之前，清除物镜或聚光镜表面的任何污染灰尘，并更换应变的光学元件（如果可能）。
物镜DIC棱镜对准 - 通过插入滑块或局限于固定安装座的棱镜来安装物镜（适用于使用de Sénarmont偏置延迟的系统）。棱镜就位后，用相位望远镜或伯特兰透镜再次检查物镜后焦平面。视场现在应该看起来非常明亮，但没有特征，单个暗干涉条纹沿剪切轴以45度角延伸到孔径直径（见图1（b））。根据显微镜是直立还是倒置，干涉条纹将以东北-西南（直立）或西北-东南（倒置）方向穿过物镜后孔径。无论哪种情况，干涉条纹都应明确定义，如图1（b）所示，并位于孔径的中心。
在一些DIC显微镜设计中，物镜是固定的（de Sénarmont补偿），而在其他设计中，棱镜可以通过滑块框架中的定位螺钉机构在光轴上来回平移。在后一种情况下，缓慢扭转调节旋钮，同时通过望远镜或Bertrand镜头观察物镜后焦平面。转动旋钮时，干涉条纹应从其中心位置移动到明亮后光圈的上半部分或下半部分。或者，在de Sénarmont补偿器中转动偏振片将产生相同的效果。
图 2 - 微分干涉对比度中的正偏置和负偏置
聚光镜DIC棱镜对准 - 从光学系上取下物镜，并通过旋转聚光镜转盘将最低孔径聚光镜棱镜（用于10倍物镜）摆动到位。适当的位置通常由炮塔上的红色或白色10设置（或类似的代码，例如L）标记。重新聚焦相位望远镜或伯特兰透镜，以观察物镜后焦平面中出现的干涉条纹。同样，应存在与物镜产生的条纹具有相同方向的单个条纹（正置显微镜为东北-西南或倒置显微镜为西北-东南）。聚光镜和物镜的干涉条纹应看起来几乎相同，并且沿剪切轴应具有相同的方向。
为了使用专为油浸设计的高数值孔径聚光镜清晰地观察聚光镜干涉条纹，可能需要使用摆动镜头控制杆卸下前镜头组件。如果物镜孔径中出现的条纹位置不正确，则可能需要调整聚光镜棱镜的方向或对齐方式。在大多数情况下，聚光镜棱镜组装在带有凹口或销（或锁定螺钉）的保护性圆形铝制框架中，以确保在聚光镜转塔内正确定位。有时，聚光镜棱镜可能会在没有正确对齐的情况下被迫进入转塔，这在检查干涉条纹时会很明显。如果聚光镜棱镜似乎未对齐，请咨询显微镜制造商以获取有关正确调整聚光镜DIC棱镜的说明。
标本观察 - 将显微镜对准科勒照明，偏振片和分析仪交叉，并安装两个棱镜（物镜和聚光镜），将薄的透明安装标本（例如口腔上皮细胞制剂）放在载物台上。调整显微镜以获得最大消光度，并在正射模式下通过目镜观察过程（无伯特兰透镜或相位望远镜）聚焦标本。在视场中观察到的图像应该呈现非常深的灰色，几乎是黑色的，在最大消光度下，在具有清晰定义的厚度或折射率梯度的区域（例如，细胞膜和细胞核;见图2（b））中具有明亮的高光。具有高折射率的球面试样，例如浸油滴，甚至可以充当微小的透镜，并且在物镜后孔径中观察时，具有清晰的干涉条纹或带，穿过中心区域的方向与条纹的方向相同。
在观察聚焦的标本图像时，使用滑块旋钮平移物镜DIC棱镜，或在配备de Sénarmont补偿的显微镜中旋转偏振器（或分析仪）。该动作称为引入偏置延迟，并将平移沿剪切轴平分试样的干涉条纹，并对试样外观产生相应的变化。将棱镜沿一个方向移动（正偏置）将使一个边缘的标本特征变亮，同时使另一边缘的相同特征变暗，同时使背景变亮（见图2（a））。通常，试样具有伪三维外观，具有与剪切轴方向相同的阴影投射效果。将棱镜移动到显微镜光轴的另一侧（负偏置）将反转明暗标本区域（比较图2（a）和图2（c））。
在正确安装和对准所有DIC组件的最大消光下，用相位望远镜或Bertrand透镜观察时，物镜后孔径呈现深灰色（几乎是黑色）并且相对均匀（图1（c））。在大多数情况下，后孔径的中心区域呈现漆黑，而外围的四个象限中出现一些光线证据。消光交叉通常看起来与单独使用交叉偏振片观察到的非常相似，但通常要暗得多，并且覆盖物镜后孔径的较大区域。外围周围的明亮区域（图1（c））是由聚光镜和物镜中偏振片和透镜元件表面的部分去偏振光引起的伪影引起的。
通过掩盖物镜后孔径中消光交叉外围的明亮区域，可以显着改善微分干涉对比图像。这是通过减小聚光镜孔径膜片的尺寸以消除亮边来实现的。通常，物镜后孔径尺寸应随光圈减小到全孔径的约75%或80%。当光学系统完全对齐时，消光十字看起来直立（见图1），并且可以观察到由两个宽干涉条纹组成，每个条纹呈直角形状，并在物镜后孔径的中心相遇（条纹也可以在较低质量的显微镜中以正交模式可视化）。在某些显微镜上，可以调整聚光镜和物镜位置以产生更均匀的条纹图案，从而使孔径的中心区域看起来更暗，更均匀。完成此任务是通过松开和旋转（或升高或降低）聚光镜棱镜或通过将偏振器和分析仪分离几度来完成的。显微镜偶尔会包含固定螺钉，可以调整聚光镜和物镜，但如此配备的型号越来越少。作为显微镜对准的最终检查，调整聚光镜对焦旋钮，同时检查物镜后孔径中的消光模式，以确定是否可以改进。请注意，聚光镜的大量重新定位可能会分离物镜和聚光镜DIC棱镜的共轭干涉平面之间的重叠，从而降低光学性能。
通过平移物镜或以de Sénarmont配置旋转偏振片来调整偏置延迟，可显着改善图像外观（超过在最大消光下观察到的图像）并增加对比度。这种操作对于微分干涉对比中的标本成像至关重要，并且代表了调整显微镜光学系的最后一步。在许多情况下，观察DIC图像时，整个视场上会出现光梯度。除了在标本的相对边缘存在明暗强度之外，还会发生这种情况，并且是由于光学系统产生的宽阔且模糊的场条纹伪影。具有良好匹配光学元件的显微镜使视场条纹的尺寸最大化，其可以变得如此宽阔和均匀分布，以至于整个视场呈现均匀的中灰色。然而，在大多数情况下，条纹仍然存在一些证据，并且视场从一个外围边缘到另一个外围表现出浅的光强度梯度（中等到浅或深灰色阴影）。这种伪影是特定光学配置所固有的，在观察和收集DIC标本的图像时应忽略。
DIC显微镜中的补偿器
还可以通过在DIC显微镜的光路中引入延迟板（或补偿器）来增加标本对比度。通常，将全波（也称为一阶补偿器）板插入物镜和分析仪之间的中间管中，尽管该板也可以位于偏振器之后但聚光镜棱镜之前。这些板在绿色区域（通常接近550纳米）的指定值处表现出整个波长的延迟水平，并导致试样沿折射率和厚度梯度显示黄色和蓝色牛顿干涉色。由于从白光中减去绿色波长，背景呈现洋红色。
图3-带一阶补偿器的DIC物镜后孔径
在de Sénarmont或标准（可翻译）Nomarski棱镜DIC显微镜配置中，当物镜与消光干涉条纹一起定位在光路中心时，在物镜后焦平面上观察到类似于图1（b）所示的图案（前提是从光路中移除聚光镜）。如果在物镜和分析仪之间放置一个全波延迟板，则图3（a）所示的干涉图样显示牛顿干涉颜色的光谱，出现在物镜后焦平面上。从光路中取出物镜并插入聚光镜棱镜可产生图3（c）所示的图案。当物镜和聚光镜棱镜都存在于光学序列中并调整到消光位置时，物镜后焦平面中可见洋红色（图3（b））。
平移物镜Nomarski棱镜或在de Sénarmont补偿器配置中旋转偏振片将改变图3（b）所示的牛顿干涉图案颜色。引入负偏差会将牛顿颜色转换为减法值（黄色），而将棱镜转换为正偏差值将导致加色（蓝色）。可以将样品梯度产生的颜色与米歇尔-利维参考图进行比较，以确定光程差异的大小。
