研究实验室的硬件和软件影响:荧光原位杂交

2022-11-04 14:52:02 浏览:69

前言

自从文献中出现第一篇引入原位杂交作为检测和研究染色体和细胞中DNA序列的方法的研究文章以来,已经过去了近四分之一个世纪。然而,在过去的15年中,通过荧光技术的发展,光学显微镜发生了一场革命,该技术在定位,鉴定和记录生物医学样品的基因组成数据方面具有前所未有的便利性,精度和准确性。

 

研究实验室的硬件和软件影响:荧光原位杂交

图1-多色FISH实验

 

通过同时使用多种荧光颜色,可以大大扩展原位杂交的能力。多色荧光原位杂交(FISH)以其最简单的形式可用于鉴定杂交中使用的不同荧光团的标记特征。通过不仅使用单一颜色,而且使用颜色组合,可以使用数字成像显微镜在单个细胞中同时检测更多标记特征。

图1所示为典型的多色FISH标本。正常男性淋巴细胞与FITC生物素标记的Chr2l和ChrY探针以及CY3地高辛标记的Chrl3和ChrY探针杂交。左上角是用DAPI染色的DNA细胞核的图像,使用DAPI过滤器组拍摄。右上角是用FITC染色的Chr21和ChrY的图像,使用FITC滤镜组拍摄。左下角是使用CY3滤光片组拍摄的用CY3染色的Chrl3和ChrY的图像。右下角的图像是连接的颜色合成图像,以彩色显示所有目标染色体。该标本由马萨诸塞州弗雷明汉综合遗传学的Tim Houseal博士提供。

如今,多色 FISH 技术与数字成像技术相结合,为多个核酸序列的非同位素检测提供了无与伦比的功能,用于分析细胞成分、染色体和基因。

荧光是一种化学物质在一个光波长下激发以不同的波长发射通常更长波长的光的现象,在整个生命科学中用于研究各种结构和细胞内活动。在过去十年中,探针和显微镜技术的进步导致了荧光技术的快速发展。

这篇评论文章将涵盖 FISH 技术的基础知识;研究人员多年来在使用FISH时面临的限制;影响该技术发展的硬件、软件、探针和试剂的最新发展;以及该领域的最新发现。随着FISH技术开始从纯研究扩展到临床诊断环境,还将回顾FISH的新发展。

FISH技术概述

FISH 在基因组学、细胞遗传学、产前研究、肿瘤生物学、辐射标记、基因图谱、基因扩增和基础生物医学研究中的使用正在迅速增长。原则上,该技术非常简单。

杂交反应识别或标记靶基因组序列,以便研究它们的位置和大小。来自适当的染色体特异性探针的DNA或RNA序列首先用报告分子标记,然后通过荧光显微镜进行鉴定。然后将标记的DNA或RNA探针杂交到载玻片上的中期染色体或相间核。洗涤和信号放大后,通过荧光显微镜筛选样品中的报告分子。

FISH允许非常精确的形态和基因组结构的空间分辨率。该技术快速、易于实施,并提供出色的探头稳定性。根据所使用的探针,可以识别特定物种的基因组,整个染色体,染色体特异性区域或单拷贝独特序列。

以前的限制

直到最近,FISH 还受到硬件、软件、试剂、探针技术和实施该技术所涉及的成本的限制。

针对多色FISH优化的商用显微镜硬件直到1990年代中期才可用。在此之前,显微镜必须针对FISH应用进行定制。大多数显微镜光学元件并非设计用于检测FISH信号中固有的低光水平。随着该技术的基因组分辨率急剧提高,对显微镜光学器件的要求也进一步提高。多个波长之间的色差一直是一个问题。特别是对于多色分析,所有镜片,包括收集镜,都必须进行色度校正。此外,落射荧光光源难以对准均匀照明。

多色FISH图像的分析需要用(a)单独的滤光片立方体隔离各种信号;或(b),利用带有多通二向色性和势垒滤波器的激发滤光片轮。滤光片技术的最新发展纠正了以前由于单个滤光片立方体的机械切换而导致的光学错位而遇到的一些问题。与多通道二向色和势垒滤光片一起使用的激发滤光片转盘可以有效地用于多达三种颜色,方法是为每种颜色使用单独的激发滤光片,而不会发生套准偏移。但是,对于三种以上的颜色,仍然必须使用单通滤光片。

高速彩色胶片或CCD(电荷耦合器件)相机用于收集数据,并且存在色彩保真度问题。此外,在单个标本中叠加使用不同探针获取的不同颜色的图像的过程存在局限性。

能够定量分析用荧光试剂制备的样品的成像软件也受到限制,因为现有的图像分析系统没有针对荧光样品进行优化。视觉分析是一个劳动密集型且通常是主观的过程,在某些情况下,如果不使用先进的荧光成像功能,荧光样品的分析是困难和模棱两可的。研究人员通常必须让软件开发人员创建自己的内部图像分析软件。幸运的是,今天制造商提供了许多软件选项,包括尼康的NIS-Elements显微镜软件。

试剂和探针本身不足以满足所有应用的需求。例如,杂交位点检测的效率随着探针尺寸的减小而降低,从而对通过荧光显微镜观察到的内容产生了显着的限制。不同颜色荧光染料的数量有限,染料的光稳定性较差。但是,来自联邦政府资助的人类基因组计划的荧光染料技术和衍生技术的新发展现在正在产生影响。所有人类染色体都有探针,并且越来越多的新基因特异性探针可用。原位杂交试剂盒和荧光标记探针可从几家公司获得。

成本是另一个主要障碍。由于市场上没有商用FISH系统,研究人员不得不组装定制系统,包括试剂、探针、显微镜、成像硬件、软件以及数据分析和报告功能。同时进行多色FISH和复杂的图像分析可能会花费研究人员超过20万美元,这是大多数临床研究人员不容易获得的金额。结果,许多希望在实验室中使用FISH的研究科学家被禁止这样做。

FISH 已广泛使用

许多硬件和软件制造商已经开发出为定制系统创建负担得起的商业替代品的方法。参与FISH的许多公司和实验室之间已经形成了合作精神,从而取得了新的突破。作者将参考他们自己经验的发展作为此类系统的例子。

美国使用的一个系统,提供中等价位的商用FISH系统用于研究,由许多制造商的组件组成,并依赖于图像分析软件,显微镜硬件和配件的最新发展。临床研究实验室会发现该系统可用于各种应用。该系统提供集成和自动化,以最终处理临床试验量。

 

图2 - MultiFluor软件数据屏幕 

 

这里展示的软件系统是MultiFluor(TM)多参数成像软件(生物检测系统),这是一个基于Microsoft® Windows(微软公司,华盛顿州贝尔维尤)的系统,可以检测,分析和显示多色FISH样品的结构和分子特征。通过关联每个样品中在不同波长下测量的多个特征,可以提高分析时间和准确性。该系统有助于图像采集、图像存储、数据库管理、显微镜自动化控制和全功能图形数据分析。

图2所示是 MultiFluor软件数据查看屏幕。用户可以使用各种交互式图形绘图工具(包括直方图、散点图等)一起查看图像和相应数据,并将来自多种颜色(波长)的多参数数据关联起来。在这里,多个数据图与细胞的选定多色图像集(显示DAPI细胞核,FITC-ChrX,CY3-ChrY和CY5-Chr2l)一起显示,以及表中所示的原始数据测量值。

FISH 研究人员可以自动捕获多个波长和多个焦平面的图像,可视化多色 FISH 探针,注释和打印图像,以及存储和检索大量多色图像数据集。可以分析多色FISH中期染色体,包括基因图谱,CGH(比较基因组杂交)比率和核型生成。用户可以选择的样品区域可以扫描和分析。该软件自动聚焦,采集多个波长的图像,记录细胞的载玻片位置,并测量多种特征,包括探针计数、荧光强度和细胞形态测量。可以关联各种波长的多个特征。

该系统的另一个功能是它能够与联网的个人计算机(PC)一起工作。在典型设置中,一台PC是连接到相机和显微镜硬件的在线分析站。该PC处理图像采集和即时分析。其他 PC 用作辅助审查站,用于分析第一台 PC 产生的结果,或离线执行专业分析。

该软件允许所有图像组件以鲜艳的伪彩色显示,以进行多色同时成像。例如,使用 DAPI(蓝色)、FITC(绿色)、CY3(红色)和 FITC-CY3(黄色)组合的同步四色实验的图像都可以单独显示,也可以组合形成彩色合成图像(如图 1 所示)。每个图像都可以交互式增强以显示感兴趣的特征。此外,直方图、散点图、电子表格、折线图和其他形式的数据制表和查看都可以通过该软件轻松创建(图 2)。最后,数据以易于访问的流行数据库格式进行维护,并且可以存储为 TIFF、JPEG、GIF 或其他文件。

落射照明

自动显微镜硬件也是该系统的一部分。Optiphot和后来的型号显微镜系统(尼康仪器公司,梅尔维尔,纽约)具有自动化的,计算机驱动的XYZ载物台和聚焦系统,旨在存储每个物体的坐标。因此,只需单击重新定位细胞按钮上的鼠标,即可在显微镜载玻片上立即调用重要的细胞和染色体位点,从而可以进行更广泛的显微镜目视检查或查看。

显微镜系统最重要的优点之一是开发了专为FISH应用设计的照明器。Quadfluor(TM)和更高型号的落射荧光照明器(尼康仪器公司)可接受多达四个荧光滤光片立方体,并显着提高亮度和对比度,这对于使用多种荧光染料的研究人员来说是重要的优势。

使用照明器,执行FISH和其他先进荧光技术的研究人员可以自由地使用四个或更多不同的探针,而无需停下来更换滤光片立方体。通过用于在四个过滤器之间切换的非常精确的线性滑块的平滑移动,确保了出色的图像配准。

滤光片立方体通过使用激发器、二向色性和挡板滤光片技术提供更高的亮度和非常高的对比度;内部光线莫名其妙;挡板滤波器的高精度斜安装角度;和专有的减反射涂层。此外,落射荧光照明器一次最多可容纳四个立方体,用于分离不同的荧光信号,或者可以与多波段滤光片立方体一起使用,以同时对多个荧光染料进行成像。

高透射物镜对于染色体上微小的感兴趣区域成像也是必不可少的。CFI60计划氟物镜(尼康仪器公司)采用光学水泥和高透射涂层,可实现更宽的波长范围和更明亮的图像。物镜没有颜色和球面像差,并提供极高的对比度和低背景自发荧光。

几家制造商目前正在开发其他计算机控制的显微镜附件,以创建先进的电动系统,这些系统将是模块化的,甚至更实惠的研究和临床应用。相机是系统的另一个重要考虑因素。可以使用数字CCD或增强型摄像机采集图像。该系统的关键因素是它们能够在不牺牲保真度的情况下执行低光成像。使用适当的软件,可以通过全自动显微镜自动设置相机设置,以确保准确性和易用性。

癌症、产前和生物学研究

这里描述的FISH系统旨在比旧的定制系统更多的研究人员使用,正在癌症研究,病理学,细胞遗传学和发育生物学中得到更广泛的应用。其应用包括分析间期细胞的多色探针斑点计数、免疫表型、细胞形态测量和 DNA 含量。

该系统正在使用测试与膀胱肿瘤相关的染色体拷贝数畸变,与总DNA含量相关。在产前研究中,该系统可用于测试与产前缺陷(包括唐氏综合症、特纳综合征、克兰费尔特综合征等)相关的相间核中的非整倍性。在细胞和发育生物学研究中,该系统可用于绘制细胞表面标志物的存在和相对分布,例如受体、细胞质标志物(包括细胞骨架蛋白)、信使 RNA 和特定基因。

诊断潜力

在过去的十五年里,研究人员已经知道FISH技术不仅具有非凡的潜力,不仅可以作为纯研究的工具,还可以用于产前诊断,细胞遗传学和肿瘤评估等领域的临床诊断。缺乏高水平、价格适中的系统不仅减缓了大多数研究人员获得FISH的速度,而且还阻止了该技术在诊断医疗保健环境中不可避免地扩大可及性。

该系统最重要的后果之一是,它可以提供过去只有昂贵的定制配置系统才能提供的高级结果。将FISH不仅应用于更广泛的生物医学研究应用,而且还满足患者的直接需求的梦想可能会在不远的将来成为现实。

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