定义
荧光显微镜是一种利用样品内的荧光获取样品（通常是生物材料）显微图像的技术，通常用锐聚焦的衍射极限激光束激发。 激光束的焦点通过样品进行光栅扫描（例如使用振镜），并且用一些光学器件收集样品中激发的荧光并用光电探测器监测。 残余激光，例如可能散射到检测器但不携带有用信息，可以在检测器之前用滤光片消除。 荧光显微镜通常与计算机（PC或笔记本电脑）一起操作，计算机控制扫描，记录荧光强度，最后生成，处理和存储获得的图像。 例如，这种设备广泛用于生物医学成像。
通常使用共聚焦几何形状（图1）（→共聚焦扫描显微镜），其中来自样品焦点的光被成像到针孔上，从而抑制来自其他区域的光（例如来自焦点之前）。 与传统显微镜相比，这允许使用相对较厚的样品，并产生高深度分辨率。 为了获得最佳性能，所使用的显微镜物镜必须具有适当的消色差特性，以便荧光载玻片在针孔处具有正确的焦点位置。
荧光可以来自样品中天然存在的分子，也可以来自样品制备过程中引入的染料分子。 图像对比度可能来自荧光分子上不同的浓度，或者来自对这些分子的影响，例如改变其荧光寿命（见下文）。
图1：共聚焦荧光显微镜的设置。
对使用的滤光片的要求可能很高，因为与强激光相比，产生的荧光可能相当微弱，并且波长分离通常不是很大。
单光子显微镜
在最简单的荧光显微镜形式中，激光连续操作，其波长选择在荧光分子的吸收光谱区域中，因此可以通过单光子吸收激发。 然而，该技术已被越来越多的多光子显微镜所取代，如下一节所述。
多光子显微镜
荧光显微镜的一个重要变体是利用荧光的多光子激发。 这里使用来自锁模激光器的飞秒脉冲，其中激光波长不在线性吸收区域，但由于峰值强度高而发生多光子吸收（通常是双光子或三光子吸收）。 然后激光波长通常在近红外区域。 多光子荧光显微镜需要更昂贵的激光系统，但其优点是多方面的和实质性的：
- 一个经常被引用的优点是，由于其非线性性质，吸收更集中在光束焦点上，因此横向和轴向的分辨率都提高了。 然而，对于横向方向，应该考虑到使用单光子显微镜通常会使用波长较短的光，这些波长可以更紧密地聚焦。
- 由于激发的荧光自然集中在焦点中，因此实际上没有必要使用共聚焦检测（见上文）；消除针孔可提高检测效率。 在某些情况下，荧光甚至可以在侧面检测到，而不是在激光束的方向或与之相反的方向上检测到。
- 通过将激发更好地集中在“有用”区域，可以最大限度地减少光漂白效应。
- 多光子显微镜中使用的波长较长的光经历的散射和吸收要少得多，例如在生物样品中，因此可以穿透较厚的材料层，因此可以使用较厚的样品。 此外，长波长的光对活细胞的不利影响要弱得多。
- 时间门控检测允许在激发脉冲后的特定时间间隔内监测荧光强度。 这使得测量局部荧光寿命成为可能，这也可用于获得良好的图像对比度。 这种技术称为FLIM=荧光寿命成像显微镜。 一种变体是FRET=荧光共振能量转移，其中利用从激发分子到样品中其他分子的能量转移。 其他相关技术利用波长可调激光器来获得附加信息，例如通过调谐到不同荧光分子的吸收波长。
图2：细胞的荧光显微镜图像，在加州大学圣巴巴拉分校的综合显微镜设施获得，由Kalju Kahn博士友好提供。
请注意，对于多光子激发，激光和荧光之间的波长差异特别大。 这使得过滤器的设计要求降低。 另一方面，显微镜物镜需要专门设计，不仅要针对所有相关波长的高透射率，还要针对尽管波长差异很大但焦距值相当相似。
在双光子显微镜中，通常在1μm光谱区域使用锁模激光器。 使用1.3μm左右的激光源进行三光子激发具有优势，因为较长波长的辐射在组织中表现出较少的散射，并且可以产生更好的轴向分辨率。 然而，1.3μm超快激光源的制造难度要大得多；通常需要光学参数振荡器。 理想情况下，人们有一个波长可调光源，可以适应不同的染料，并理想地利用每种染料，使显微镜设置特别通用。
用于超分辨率的受激发射损耗显微镜
荧光显微镜的另一种变体是受激发射耗尽显微镜（STED显微镜）[2-4，12]。 在这里，荧光标记物质首先用高斯形泵浦脉冲激发。 此后不久，具有甜甜圈（甜甜圈）形状（中心强度为零）的第二个脉冲被发送到同一位置。 第二个脉冲的波长稍长，因此它主要引起受激发射，这优先耗尽围绕原始光斑中心的环中的激发区域。 结果，保留了较小的激发区域，可以利用这一点来实现低于100 nm的显着更高的空间分辨率，有时甚至低于20 nm。 该分辨率比光学显微镜（近场显微镜除外）的正常分辨率要好得多，即阿贝的分辨率极限被打破。
2014年，诺贝尔化学奖[18]授予Eric Betzig，Stefan W. Hell和William E. Moerner“以开发超分辨率荧光显微镜”。 Stefan W. Hell开发了STED显微镜，而Eric Betzig和William E. Moerner开创了另一种称为单分子显微镜的方法，该方法也允许创建超分辨率图像。 该奖项认可，根据恩斯特·阿贝的计算，长期存在的分辨率限制最终可以超越；现在，人们甚至可以使用术语纳米学而不是显微镜来表示这些成像方法，因为长度尺度远低于微米的结构（因此在纳米范围内）已经变得容易获得。 这大大拓宽了光学显微镜的应用领域。 可能有些令人惊讶的是，物理学领域的进步已经成为诺贝尔化学奖的基础，但斯特凡·赫尔的重要工作实际上是在哥廷根的马克斯普朗克生物物理化学研究所完成的，一些重要的应用在于化学和生物学领域。
随机光学重建显微镜
荧光显微镜的另一类方法是随机光学重建显微镜（STORM），也称为（荧光）光活化定位显微镜（（F）PALM）[6-8，11]。 在这里，制备样品（通常是一些生物材料）使得它含有低浓度的某些荧光分子，其优选在样品中占据某些位置，例如在细胞内的微管中。 如果检测到来自每个分子的足够多的荧光光子，并且荧光团具有足够大的相互距离，则可以以远低于衍射极限的分辨率定位这些荧光分子（荧光团，荧光标记）。 （这种分子的图像是一个较大尺寸的斑点，但如果不同的斑点不重叠，则可以非常精确地确定其中心。
用这种方法拍摄的单个图像只能显示某些位置，即某些荧光团的位置。 通过组合多个图像可以获得样品的完整图像，其中不同的荧光团组被激活。 荧光基团的活化和失活是通过扫描激光束的影响发生的，因为荧光团可以在荧光状态和“暗”状态之间切换。
应用
如上所述，荧光显微镜主要用于生物样品，例如科学研究和医学诊断。 目前正在研究哪种形式的荧光显微镜可用于例如检测癌症。 它也可用于活细胞成像。 特别是使用多光子荧光显微镜，例如，可以在不严重影响细胞的情况下观察细胞分裂，而细胞通常不能容忍长时间的单光子激发。
参考文献
[1] W. Denk et al., “Two-photon laser scanning fluorescence microscopy”, Science 248, 73 (1990), doi:10.1126/science.2321027
[2] S. W. Hell and J. Wichmann, “Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission”, Opt. Lett. 19 (11), 780 (1994), doi:10.1364/OL.19.000780
[3] S. W. Hell, and M. Kroug, “Ground-state depletion fluorescence microscopy: a concept for breaking the diffraction resolution limit”, Appl. Phys. B 60, 495 (1995), doi:10.1007/BF01081333
[4] T. A. Klar et al., “Breaking Abbe's diffraction resolution limit in fluorescence microscopy with stimulated emission depletion beams of various shapes”, Phys. Rev. E 64 (6), 066611 (2001), doi:10.1103/PhysRevE.64.066613
[5] M. Dyba and S. W. Hell, “Focal spots of size λ/23 open up far-field fluorescence microscopy at 33 nm axial resolution”, Phys. Rev. Lett. 88 (16), 163901 (2002), doi:10.1103/PhysRevLett.88.163901
[6] M. J. Rust et al., “Sub-diffraction-limit imaging by stochastic reconstruction optical microscopy (STORM)”, Nature Meth. 3, 793 (2006), doi:10.1038/nmeth929
[7] E. Betzig et al., “Nanometer resolution imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution”, Science 313 (5793), 1642 (2006), doi:10.1126/science.1127344
[8] S. T. Hess et al., “Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy”, Biophys. J. 91, 4258 (2006), doi:10.1529/biophysj.106.091116
[9] B. Harke et al., “Resolution scaling in STED microscopy”, Opt. Express 16 (6), 4154 (2008), doi:10.1364/OE.16.004154
[10] D. Wildanger et al., “STED microscopy with a supercontinuum laser source”, Opt. Express 16 (13), 9614 (2008), doi:10.1364/OE.16.009614
[11] X. Zhuang, “Nano-imaging with STORM”, Nature Photon. 3, 365 (2009), doi:10.1038/nphoton.2009.101
[12] S. W. Hell et al., “Diffraction-unlimited three-dimensional optical nanoscopy with opposing lenses”, Nature Photon. 3, 381 (2009), doi:10.1038/nphoton.2009.112
[13] G. Moneron and S. W. Hell, “Two-photon excitation STED microscopy”, Opt. Express 17 (17), 14567 (2009), doi:10.1364/OE.17.014567
[14] E. E. Hoover and J. A. Squier, “Advances in multiphoton microscopy technology”, Nature Photon. 7, 93 (2013), doi:10.1038/nphoton.2012.361
[15] P. Gao et al., “Background suppression in fluorescence nanoscopy with stimulated emission double depletion”, Nature Photon. 11, 163 (2017), doi:10.1038/nphoton.2016.279
[16] J. Mertz, “Strategies for volumetric imaging with a fluorescence microscope” (review paper), Optica 6 (10), 1261 (2019), doi:10.1364/OPTICA.6.001261
[17] J. Wu, N. Ji and K. K. Tsia, “Speed scaling in multiphoton fluorescence microscopy” (review article), Nature Photonics 15, 800 (2021), doi:10.1038/s41566-021-00881-0
[18] Nobel Prize in Chemistry 2014, https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2014/summary/
[19] National High Magnetic Field Laboratory, Optical microscopy primer on fluorescence microscopy, (http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/fluorescence/fluorhome.html)
