定义
明场照明(Bright-field illumination)是照明光直接透射样品或被样品反射进入物镜从而在明亮背景上显示深色样品图像的照明方法。
照明原理
明场照明主要分为两种。一种是透射光亮视场照明,光通过透明物体,例如透明玻璃光栅等,光被透明光栅的不同透射比所调制。若光通过无缺陷的玻璃平板,则产生一均匀的亮视场。照明光路如图1所示。
图 1 透射光亮视场照明光路图
另一种是反射光亮视场照明,对不透明的物体,例如金属表面,必须从上面照明。一般通过物镜从上面照明。光束被不同反射率的物体结构所调制。没有缺陷的漫射或者规则的反射表面产生一均匀的亮视场[1]。照明光路如图2所示。
图 2 反射光亮视场照明光路图
因此明视野显微镜的光路非常简单,除了普通的光学显微镜设置外,不需要其他组件。光路主要包括:透照光源,通常是显微镜支架中的卤素灯;聚光镜,将来自光源的光聚焦到样品上;物镜,从样品收集光并放大图像;目镜和/或照相机以查看样本图像。
明视野显微镜可以使用临界或柯勒照明来照亮样品[2-3]。
明场照明特点
明视野照明显微镜通常对大多数生物样品的对比度较低,因为样品很少会吸收大量光。通常需要进行染色以增加对比度,从而在许多情况下无法在活细胞上使用。明场照明对于具有固有颜色的样品(例如植物细胞中的叶绿体)很有用。
明场照明的优点主要在于设备安装简单而且所需的设备非常基础,但局限性也有非常明显。大多数生物样品的对比度非常低。用光学显微镜放大的实际极限约为1300×。尽管可以使用更高的放大倍率,但随着放大倍率的增加,保持图像清晰度变得越来越困难[4]。自然无色和透明的样品不能很好地看到,例如许多类型的哺乳动物细胞。这些样品通常必须在观看之前进行染色。
明场照明提升的方法主要是:
(1)使用油浸物镜和特殊浸油放置在样品玻璃盖上,提高观察样品的分辨率;
(2)在微生物雪中可以采用染色的方法,例如简单染色和差异染色;
(3)使用彩色(通常为蓝色)光源或偏光滤镜以突出显示在白光下不可见的特征。其中偏光滤镜的使用对矿物样品特别有用[5]。
图3显示了在暗场照明和明场照明条件下的薄棉纸样品的成像情况,可以看到在相同条件下,暗场照明的对比度更高,显示的细节更丰富。
图 3 明场照明和暗场照明对比图
参考文献
[1] 工程光学 [M]. 机械工业出版社,郁道银,谈恒英, 2017
[2] 王海鹏. 基于DMD的红外目标模拟光学系统研究[D]. 2016.
[3] Chaves, Julio (2015). Introduction to Nonimaging Optics, Second Edition. CRC Press. ISBN 978-1482206739.研究[D].长沙:湖南大学, 2014.
[4] Microbiology: Principles and Explorations by Jacquelyn G. Black, John Wiley & Sons, Inc. (2005)
[5] 何璇. 明场、暗场、相衬的多模显微镜成像技术研究[D].电子科技大学,2017.