宽视场高分辨傅里叶叠层显微镜

2022-08-09 16:40:33 浏览:1072

宽视场高分辨傅里叶叠层显微镜

作者:Guoan Zheng, Roarke Horstmeyer, Changhuei Yang

文章题目:Wide-field, high-resolution Fourier ptychographic microscopy

期刊:Nature Photonics

文章链接:https://doi.org/10.1038/nphoton.2013.187

成像系统的通量从根本上来说受到光学系统的空间带宽积(SBP)的限制,SBP描述了成像系统传递信息的能力,它决定了像面上可以分辨像元的数目。常规显微系统的SBP通常是百万像素级的,与使用的物镜的放大倍数(M)或数值孔径(NA)无关。这里举例说明,以×20显微镜物镜(MPLN×20,0.4 NA,Olympus)为例,横向分辨率为0.8 µm,视场直径(FOV)为1.1毫米,对应的SBP约为7百万像素。常规显微系统的SBP从根本上来说受到系统的器件参数的限制,在实际的应用中我们总是在分辨率和FOV之间相互取舍。

郑国安教授团队研制了一种新型成像技术,名为傅里叶叠层显微镜(Fourier ptychographic microscopy,FPM),这项技术通过将多张不同照明下的低分辨率图像在傅里叶空间进行反复迭代,从而得到大视场高分辨率的图像。利用自适应光学中的波前修正技术,FPM也具备校正像差的能力,拓展了显微镜的景深。作者搭建了演示样机,实现了0.78μm的分辨率,~120mm2的视场,保持分辨率不变的条件下景深达到0.3mm(波长632nm),并且拍摄得到了病理学组织切片的亿像素彩色图像。这一成像技术通过迭代计算的方式解决了高通量,高分辨率显微镜通常所受到的光学系统的限制。

FPM的系统结果简单,文章中的样机以商用显微镜Olympus BX 41为基础,物镜采用×2复消色差物镜(Plan APO,0.08 NA,Olympus),相机采用CCD (Kodak KAI-29050,5.5 µm),在此基础上引入了一个可编程的彩色LED阵列置于样品台下方约8厘米处,作为可变照明源。通过不同角度LED照明下拍摄到的多张包含不同频域信息的低分辨率图像来重建出高分变率的图像。

宽视场高分辨傅里叶叠层显微镜

FPM样机 a:FPM结构图,一个可编程的LED阵列放置在样本下方;b:实验所用LED阵列和显微镜,每个LED都可以提供红绿蓝单色的窄带光照明;c1:USAF分辨率板全图;c2:c1的局部放大图,像素尺寸2.75μm;d:FPM对c1相同区域的重建结果,重建像素尺寸0.275μm,重建后等效的的最大NA为0.5

尽管FPM方法不需要相位信息作为输入,但在FPM的迭代算法重建过程中可以得到物方的相位信息,因此作者将自适应光学技术引入重建算法,在瞳函数处补偿像差,可以将FPM的景深扩展到原物镜的景深之外,从而避免了传统显微镜需要将样本与物镜工作距离精确匹配带来的不便。

将红、绿、蓝LED照明下得到的图像整合到相应的颜色通道中,就可以得到彩色FPM图像。通过PFM样机对病理载玻片(人乳腺腺癌,Carolina)的实际成像,文章展示了其在大视场下的实际成像效果,如下图所示,重建像素尺寸0.275μm,视场达到~120 mm2

宽视场高分辨傅里叶叠层显微镜

FPM拍摄得到的亿像素彩色图像 a:病理学切片的大视场彩色图像,2.3亿像素;b,c1,d,e:图a的局部高分变率放大图;c2,c3:作为比较,传统显微镜在×20(c2)和×2(c1)物镜下得到的图像。图c2和c3用彩色相机(DFK 61BUC02, Image Source)拍摄。

亮点点评

在不同角度LED照明条件下,利用低数值孔径(NA)物镜拍摄到包含不同频域信息的多张图像,经过迭代算法得到了高分辨的图像,同时保持了小NA物镜对应的大的成像视场,在~120mm2的视场下实现了0.78μm的分辨率,突破了光学系统对成像空间带宽积(SBP)的限制;其迭代算法可以引入自适应光学来校正像差,在一定范围内消除离焦对图像的影响,拓宽了成像的景深,不损失分辨率的情况下实际景深达到0.3mm。FPM系统的结果简单,常规宽场显微镜加装LED阵列即可实现,且不需要扫描振镜,改造成本低。诸多生物应用例如病理学,血液学,免疫组织化学和神经解剖学对提高显微镜的空间带宽积,即大视场高分变率成像有迫切的渴望,而FPM通过简单的结构即可实现其需求,同时Patterned-illumination的FPM变体可以用于荧光成像,进一步拓宽了其应用范围。

总的来说,PFM通过简单的光路结构突破了光学系统对空间带宽积的限制,实现了0.78μm的分辨率,~120mm2的视场,利用自适应光学中的波前修正技术,FPM也具备校正像差的能力,在保持分辨率不变的条件下景深达到0.3mm(波长632nm),同时其变体可以应用于荧光成像,满足诸多生物应用的成像需求。

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