文章信息
作者：Jelmer Cnossen, Taylor Hinsdale, Rasmus Ø. Thorsen, Marijn Siemons, Florian Schueder, Ralf Jungmann, Carlas S. Smith, Bernd Rieger, Sjoerd Stallinga
文章名：Localization microscopy at doubled precision with patterned illumination
期刊：Nature Methods
发表日期：2019.11.09
链接：https://doi.org/10.1038/s41592-019-0657-7
摘要
MINFLUX（最小光通量技术）在单分子定位精度方面有了突破，但受限于视场大小。在这篇文章中,我们在一台传统的宽场成像设备中结合质心估计和照明图案引起的光子计数变化来在一个典型的微米大小的视场中提取位置信息。在用相同光子数对细胞中的DNA折叠纳米结构和微管蛋白成像时，应用DNA-PAINT和STORM技术的MINFLUX显微镜实现了相对于标准单分子定位技术近一倍的分辨率提升。
系统结构图
激光器发出的激光通过SMF（单模光纤）后经PC（普克尔斯盒）调制偏振方向，再经PBS透射或反射后通过LP（线性偏振片）和G1,2（二值线性相位光栅），然后经PBS透射或反射后经透镜L3在SF（空间波滤波器）形成衍射图案，其中只有±1级衍射斑通过SF，然后通过两透镜组成的4F系统聚焦在物镜后焦面，经物镜折射后变成两束平行光，在样本处发生干涉形成正弦条纹，激发的荧光经过物镜和TL（套筒透镜）后被相机收集。
主要结果图/视频
(q)(r)：SMLM（单分子定位显微成像技术）和SIMFLUX对40 nm间隔的DNA折叠网格的成像结果；(s)(t)：SMLM和SIMFLUX对20 nm间隔的DNA折叠网格的成像结果。可以看到SIMFLUX相对SMLM有明显的分辨率提升。Scale bar：50 nm。
(a)：应用DNA-PAINT技术的SIMFLUX显微镜拍摄的细胞微管蛋白宽场图像，视场大小为26 μm。Scale bar：5 μm。(b)(c)(d)：(a)中三个方框内区域SMLM和SIMFLUX图像的放大图。(e)：(d)中微光蛋白细丝横断线上的光子数分布及其双高斯拟合结果。可以看到在SMLM图像中很难分辨的两条紧挨着的细丝在SIMFLUX图像中能够得到明显的区分。Scale bar：(b)(c) 1 μm, (d) 0.25 μm。
亮点点评
单分子定位显微成像技术经过十几年的发展，涌现出了PALM，STORM，DNA-PAINT等技术，让人们得以探索生命体神秘的微观结构；而SIM（结构光照明显微成像技术）用另一种途径实现了超分辨，同样发展为了相当成熟的技术。这篇文章将两种技术有机结合起来，进一步提高了成像分辨率。这篇文章中将成熟的DNA-PAINT和STORM技术分别应用于SIMFLUX和普通的SMLM显微镜，成像结果的对比证实了分辨率的明显提升。SIMFLUX技术在光子数不变的条件下实现了近一倍的分辨率提升，这为人们探索生命体的更精细结构铺平了道路。
