文章名称：Integrated multimodal endomicroscopy platform for simultaneous en face optical coherence and two-photon fluorescence imaging
发表期刊：NIH Public Access
发表日期：2012年2月
1 摘要
本文中，通过将双光子荧光（TPF）成像技术和光学相干断层扫描（OCT）技术相结合，实现两种成像技术的优势互补，设计并搭建了结合两种成像技术的多模态内窥镜[1]。多模态成像系统中双光子成像激励光为1550 nm，与1310 nm的光学相干断层成像激励光共用同一根双包层光子晶体光纤（DCF）进行传输，应用压电陶瓷管（PZT）驱动双包层光子晶体光纤进行扫描。在此系统中使用光路合成器（Wavelength Division Multiplexer，WDM）将双光子激励光和光学相干断层成像激励光两路光束合并为一束复合激励光束。随后应用非球面微物镜将复合激励光束聚焦于样本表面，同时收集光学相干断层成像信号光和双光子荧光信号光，以对样本进行多模态成像。科研人员使用所搭建的多模态内窥镜对培养的细胞和小鼠组织进行成像，验证了多模态内窥镜的可行性。
2 背景
光学相干断层扫描成像（Optical Coherence Tomography，OCT）和双光子荧光成像（Two-photon Fluorescence）是两种应用较广的成像方式，在生物组织在体（In-Vivo）实时成像领域具有较大的应用前景。光学相干断层扫描成像适用于对微米级（Mircometer-scale）的组织结构进行成像，基于不同生物组织结构光程的差异进行成像。而双光子荧光成像具有较强层析能力，其分辨率为亚微米级（Submircometer-scale），通过激励光与生物组织内固有或外加荧光体发生双光子反应产生的荧光信号进行成像，可以获取组织内生物分子结构相关的信息。将两种技术相结合，实现技术优势互补，得到成像信息更全面的内窥镜成像系统，可以在生物学研究和临床医学诊断中获得更多的成像信息，具有宽广的应用前景。
3 原理
图 1 多模态内窥镜结构示意图[1]
如图1所示，多模态成像系统主要由如下两个模块组成，1550 nm双光子荧光成像系统和1310 nm光学相干断层成像系统。
在光源选择方面，选用1550 nm波长光源作为双光子荧光激励光，同时选择1310 nm波长光源作为光学相干断层成像的激励光。在多模态内窥镜成像系统中选用这两种光源的优势如下：
（1）所选两种波段的激光器光源较为常用，可以在市面上购买；
（2）所选两种波段的光源可以在同一根光纤中传播；
（3）传输所选两种波段激励光的单模光纤和双包层光子晶体光纤在传输两种激励光时，传输和散射性质相同。
选用1550 nm被动锁模增益光纤激光器产生的峰值平均功率为155 mW的超短脉冲（~300fs）激光作为激励光源，这种光源可以在单模光纤或光子晶体光纤中传播，具有相似传输特性。并且，由于1550 nm波段位于近红外波段，波长较长，照射生物组织样本时具有更高的穿透深度。在光学相干断层成像系统中应用1310 nm光纤耦合超发光二极管（Superluminescent Diode）作为光源，其发出的激励光中心波长为1310 nm同时具有80 nm的3dB带宽，并直接入射进入迈克尔逊干涉仪中。
使用波分复用器（WDM）将1310 nm的光学相干断层成像激励光与1550 nm的双光子荧光激励光合并为一路，组成复合激励光束，输入到后续的光学系统中，用于照射样本并产生信号光，以便后续成像。
波分复用器输出的复合激励光束会进入由两个非球面物镜组成的耦合物镜对（Coupling Lens，CL），主要用于将复合激励光束耦合进入双包层光子晶体光纤的纤芯层中。
多模成像系统中一个关键器件是自制的双包层光子晶体光纤，如图2所示，这种光纤分为纤芯、内包层和外包层三个部分。其中纤芯直径为8 μm，与单模光纤特性相似，用于传输波分复用器输出的由1550 nm的双光子荧光激励光和1310 nm的光学相干断层成像激励光组成的复合激励光束。内包层直径175 μm，用于收集激励光与样本反应产生的荧光信号，以及反射回系统的光学相干断层成像信号光。
图 2 双包层光子晶体光纤横截面示意图[2]
使用压电陶瓷管（PZT）固定双包层光子晶体光纤的末端，组成悬臂梁结构，其结构示意图如图3所示。通过驱动压电陶瓷管四个驱动极对应的X轴和Y轴，使得压电陶瓷管振动，并带动双包层光子晶体光纤按照一定轨迹对具有一定面积的组织样本进行扫描。
图 3 压电陶瓷驱动光纤扫描结构示意图[2]
由于复合激励光束中1310 nm部分激励光与1550 nm部分激励光存在波长差，因此在压电陶瓷管驱动光纤输出端加入补偿物镜，其结构如图4所示。补偿物镜将两种波长激励光聚焦于样本同一位置，同时收集双光子荧光信号光和光学相干断层成像信号光组成的复合信号光束，将收集到的复合信号光束耦合进入双包层光子晶体光纤的内包层中，沿光纤传输回系统中的信号光采集部分，用于成像。
图 4 多模态内窥镜补偿微物镜示意图[3]
在多模态内窥镜成像系统中，双光子荧光信号光与光学相干断层成像信号光会由不同的探测器收集并用于成像。
首先对于双光子荧光信号光，通过在系统耦合物镜对中加入二向色镜（Dichroic Mirrors，DM），在允许复合激励光束和光学相干断层成像信号光通过的同时，将800 nm波段的双光子荧光信号光反射进入光电倍增管（PMT）中。光电倍增管将扫描轨迹中每一位置，激励光与样本中荧光体发生双光子效应产生的荧光信号转换为对应光强的数字信号，并通过计算机数据处理将每一扫描位置对应的荧光强度转换为该位置像素点的灰度值，从而完成扫描轨迹中样本的双光子荧光成像。
对于光学断层成像信号光，该信号光为激励光照射样本散射产生的信号光。信号光相位与样本表面结构相对应，且波长与激励光相同均为1310 nm，因此反向传输时会穿过二向色镜，并反向传输回迈克尔逊干涉仪中的平衡探测器（Balanced Detector）中，与参考臂中电光调制器（Electro-Optic Modulator，EOM）产生的参考信号通过光学外插法探测相位差，将相位信息对应为该扫描位置像素的灰度值。使用光学相干断层扫描成像技术探测扫描轨迹中每一点的相位信息，并对应为每一个位置像素的灰度值，即可获得该片扫描区域的成像图。使用快速扫描光学延迟线（Rapid Scanning Optical Delay Line，RSOD）改变参考臂中的参考光束光程，可以选择光学相干断层扫描成像深度。
搭建上述系统可以实现对同一片样本区域同时进行光学相干断层成像和双光子荧光成像。这两种成像方式成像帧率相等，均取决于压电陶瓷管驱动光纤扫描帧率。相较于传统台式显微镜，所搭建的多模态内窥镜具有结构紧凑、成像信息种类多的特点，适用于组织实时在体成像。
4 实验
使用所搭建多模态内窥镜成像系统对癌细胞进行成像，其成像图如图5所示。使用光学相干断层扫描技术对某一片区域的癌细胞进行成像，其成像图如图 5（a）所示，其横向分辨率和纵向分辨率分别为1.2 μm和5.7 μm。通过免疫标记的方法使用Indocyanine绿色荧光染料对细胞中的细胞壁进行染色，并进行双光子成像，成像如图5（b）所示，横向分辨率和纵向分辨率分别为2.5 μm和10.0 μm。应用相应的图像处理将癌细胞的双光子荧光成像图与光学相干断层扫描成像图叠加，得到如图5（c）所示的成像图，其视场约为150 μm。
图 5 多模态内窥镜癌细胞成像图[1]
5 小总
本文所述的双光子荧光成像与光学相干断层扫描成像相结合的多模态内窥镜，在设计并搭建后，经过实验验证了其可行性。此多模态成像系统将光学相干断层扫描成像适于对组织形态进行成像的优点，与双光子荧光技术适于对组织内分子结构进行成像的优点进行结合，得到了对样本组织进行多模态成像的方法，从而获得信息较为全面的成像图。同时，由于内窥镜微型化探头的结构设计，使得多模态内窥镜在生物组织实时在体成像，以及临床医学诊断领域具有巨大应用前景。但是由于成本高、操作复杂的缺点，还需要研究人员不断完善其结构，以得到性能更加优秀的多模态内窥镜，更好地造福于人类。
参考文献
[1] Xi J, Chen Y, Zhang Y, et al. Integrated multimodal endomicroscopy platform for simultaneous en face optical coherence and two-photon fluorescence imaging. Optics Letters, 2012, 37(3):362.
[2] Myaing M T, Macdonald D J, Li X. Fiber-optic scanning two-photon fluorescence endoscope. Optics Letters, 2006, 31(8):1076-1078.
[3] Wu Y, Xi J, Cobb M J, et al. Scanning fiber-optic nonlinear endomicroscopy with miniature aspherical compound lens and multimode fiber collector. Optics Letters, 2009, 34(7):953-955.
