选择荧光蛋白进行双标记实验

2022-11-04 14:51:15 浏览:160

前言

荧光蛋白及其色移遗传变异所表现出的宽广激发和发射光谱谱在设计同时使用两个或多个这些独特探针的活细胞成像实验时,通常需要专门的考虑。主要关注的是荧光蛋白组合通常表现出的显著程度的发射光谱重叠导致的潜在渗漏伪影。本交互式教程探讨了用于双标记研究的匹配荧光蛋白,包括光谱带宽和重叠、激发效率、发射窗口尺寸以及设计逻辑实验所需的其他参数。因此,该工具应有助于告知荧光滤光片组合的选择。

 

 

教程说明

本教程使用荧光蛋白(CFP Cerulean和HcRed-Tandem)的有用组合(CFP Cerulean和HcRed-Tandem)的吸收和荧光发射光谱图进行初始化,这些荧光蛋白组合出现在“光谱图谱”窗口中,叠加在汞弧放电灯的发射光谱上。初始化时窗口中还包括适用于荧光基团的二色镜的配置文件,以及发射滤光片带宽配置文件的建议起点。鼠标光标可用于沿“光谱图”窗口的波长轴拖动灰度发射滤光片带宽边界,以确定最佳位置。每个发射滤光片控件右侧的双滑块组合或箭头按钮可用于调整带宽,并且可以使用左侧箭头按钮更改中心波长。拖动左侧滑块还会在图形中转换带宽配置文件,而拖动右侧滑块会增加或减少带宽大小。虚拟发射滤光片的当前中心波长和带宽值会不断更新,并以滑块上方的红色数字显示。每个通道的渗漏百分比(如果有)会持续更新,并显示在“光谱图”窗口下方。

二色镜滑块控制这些元素的截止波长曲线位置,并可以使用滑块旁边的颜色编码单选按钮在每个通道之间切换。同样,可以通过停用激发源复选框来关闭汞灯光谱图。通过从照明源黄色显示窗口(默认:汞弧灯)上方的框中删除复选标记,可以禁用吸收 (Ab) 和发射 (Em) 光谱曲线。从照明下拉菜单中选择激光源时,基于激光波长处摩尔消光系数的激发效率百分比将显示在照明显示窗口上方的绿色框中。激光线是用近似于“光谱图”窗口中波长的颜色绘制的,可以通过禁用“激发源”复选框来停用。为了在切换探头或照明源列表时保留当前的教程参数(显示的激发和发射滤光片配置文件等),可以启用“保持状态”复选框。可以使用“光谱图”窗口右侧的一组单选按钮以及“选择探针”下拉菜单来选择新的荧光蛋白类别。

用于计算本教程值的吸收和荧光发射光谱是在受控条件下记录的,并且归一化仅用于比较和显示目的。在实际的荧光显微镜研究中,光谱图可能因环境影响(例如pH、离子浓度和溶剂极性)以及局部探针浓度的波动而变化,因此可能与在实验条件下实际观察到的光谱图不同。

 

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