前言
必须仔细选择设计用于对荧光蛋白进行成像的荧光滤光片组合，以最大限度地提高呈现给检测器的发射强度水平，同时减少自发荧光或其他荧光团渗漏的不需要的光子数量。大多数荧光蛋白表现出的宽吸收和发射光谱谱为滤光片提供了广泛的选择，这些滤光片通常针对特定检测系统（人眼、数码相机或光电倍增管）进行优化。本交互式教程旨在识别荧光蛋白成像所需的关键滤光片参数，包括中心波长、带宽区域和二色镜截止波长。
教程说明
本教程使用叠加在汞弧放电灯的发射光谱上的“光谱图谱”窗口中出现的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的归一化吸收和荧光发射光谱图进行初始化。初始化时窗口中还包括适用于荧光基团的二色镜（分光镜）的波长截止曲线，以及激发滤光片带宽和发射滤光片带宽曲线的建议起点。鼠标光标可用于沿“光谱图”窗口的波长轴拖动灰度带宽边界，以确定最佳位置。每个滤光片控件右侧的双滑块组合或箭头按钮可用于调整带宽，并且可以使用左侧箭头按钮更改中心波长。拖动左侧滑块还会在图形中转换带宽配置文件，而拖动右侧滑块会增加或减少带宽大小。虚拟激发和发射滤光片的当前中心波长和带宽不断更新，并以滑块上方的红色数字显示。
二色镜滑块控制此元素的截止波长曲线位置，并可以使用滑块旁边的复选框打开或关闭。激励和发射滤波器带宽显示也可以通过删除复选标记来禁用。同样，可以通过停用随附的复选框来关闭汞灯光谱图。通过从照明源黄色显示窗口（默认：汞弧灯）上方的框中删除复选标记，可以禁用吸收 （Ab） 和发射 （Em） 光谱曲线。从照明下拉菜单中选择激光源时，基于激光波长处摩尔消光系数的激发效率百分比将显示在照明显示窗口上方的绿色框中。激光线（在“光谱图”窗口中使用近似波长的颜色绘制）可以通过禁用“激光线”复选框来停用。为了在切换探头或照明源列表时保留当前的教程参数（显示的激发和发射滤光片配置文件等），可以启用“保持状态”复选框。可以使用“光谱图”窗口右侧的一组单选按钮以及“选择探针”下拉菜单来选择新的荧光蛋白类别。
表1-荧光蛋白过滤器组合特性
| 蛋白质 （缩写） |
激发 激光 （纳米） |
激发 滤波器 CWL / 带宽 （纳米） |
二色 镜 截止（纳米） |
发射 滤光片 CWL / 带宽 （纳米） |
相对 亮度 （EGFP的百分比） |
|
|---|---|---|---|---|---|---|
| GFP (wt) | Argon (488) | 450/50 | 480LP | 510/50 | 48 | |
| 绿色荧光蛋白 | ||||||
| EGFP | Argon (488) | 470/40 | 495LP | 515/30 | 100 | |
| Emerald | Argon (488) | 470/40 | 495LP | 515/30 | 116 | |
| Azami Green | Argon (488) | 470/40 | 495LP | 520/30 | 121 | |
| CopGFP | Argon (488) | 470/40 | 490LP | 510/30 | 125 | |
| AcGFP | Argon (488) | 470/40 | 490LP | 510/30 | 82 | |
| ZsGreen | Argon (488) | 470/30 | 495LP | 520/40 | 117 | |
| 蓝色荧光蛋白 | ||||||
| EBFP | Diode (405) | 375/50 | 405LP | 445/50 | 27 | |
| Sapphire | Diode (405) | 400/50 | 460LP | 515/50 | 55 | |
| T-Sapphire | Diode (405) | 400/50 | 460LP | 515/50 | 79 | |
| 青色荧光蛋白 | ||||||
| AmCyan1 | Argon (457) | 440/40 | 470LP | 500/40 | 31 | |
| ECFP | Diode (440) | 435/40 | 460LP | 495/50 | 39 | |
| Cerulean | Diode (440) | 435/40 | 460LP | 500/50 | 79 | |
| CoralHue Cyan | Argon (488) | 450/50 | 480LP | 505/35 | 73 | |
| 黄色荧光蛋白 | ||||||
| EYFP | Argon (514) | 490/40 | 515LP | 540/30 | 151 | |
| PhiYFP | Argon (514) | 500/45 | 525LP | 555/40 | 155 | |
| Citrine | Argon (514) | 500/25 | 515LP | 545/40 | 174 | |
| Venus | Argon (514) | 495/35 | 515LP | 545/40 | 156 | |
| ZsYellow1 | He-Ne (543) | 500/45 | 525LP | 555/40 | 25 | |
| 橙色和红色荧光蛋白 | ||||||
| CoralHue Orange | He-Ne (543) | 525/40 | 550LP | 580/40 | 92 | |
| mOrange | He-Ne (543) | 525/40 | 550LP | 585/50 | 146 | |
| DsRed | He-Ne (543) | 540/45 | 570LP | 600/50 | 176 | |
| DsRed2 | He-Ne (543) | 540/50 | 570LP | 600/40 | 72 | |
| DsRed-Express | He-Ne (543) | 540/45 | 570LP | 600/50 | 58 | |
| mTangerine | Kr-Ar (568) | 545/40 | 570LP | 600/40 | 34 | |
| mStrawberry | Kr-Ar (568) | 550/50 | 580LP | 615/50 | 78 | |
| AsRed2 | Kr-Ar (568) | 540/40 | 575LP | 620/60 | 8 | |
| mRFP1 | He-Ne (594) | 560/55 | 590LP | 630/60 | 37 | |
| mCherry | He-Ne (594) | 560/55 | 590LP | 630/60 | 47 | |
| HcRed1 | He-Ne (594) | 560/60 | 595LP | 630/50 | 1 | |
| mRaspberry | He-Ne (594) | 570/60 | 605LP | 645/60 | 38 | |
| HcRed-Tandem | He-Ne (594) | 570/70 | 610LP | 650/60 | 19 | |
| mPlum | He-Ne (594) | 570/60 | 605LP | 650/60 | 12 | |
| 光学荧光笔荧光蛋白;（N） = 天然 （P） = 光转换 | ||||||
| PA-GFP (N) | Diode (405) | 400/60 | 465LP | 530/50 | 8 | |
| PA-GFP (P) | Argon (488) | 480/40 | 505LP | 535/40 | 41 | |
| PS-CFP (N) | Diode (405) | 395/50 | 430LP | 470/60 | 16 | |
| PS-CFP (P) | Argon (488) | 470/50 | 500LP | 530/40 | 15 | |
| PS-CFP2 (N) | Diode (405) | 395/50 | 430LP | 470/60 | 26 | |
| PS-CFP2 (P) | Argon (488) | 470/50 | 500LP | 530/40 | 32 | |
| Kaede (N) | Argon (488) | 485/40 | 510LP | 535/30 | 259 | |
| Kaede (P) | Kr-Ar (568) | 540/50 | 570LP | 590/30 | 59 | |
| mEosFP (N) | Argon (488) | 490/30 | 510LP | 535/30 | 128 | |
| mEosFP (P) | Kr-Ar (568) | 540/50 | 570LP | 600/40 | 68 | |
| Kindling (N/P) | Kr-Ar (568) | 560/50 | 590LP | 625/50 | 12 | |
| Dronpa (P) | Argon (488) | 485/30 | 505LP | 530/30 | 240 | |
