选择荧光蛋白的滤光片组合

2022-11-04 14:51:22 浏览:129

前言

必须仔细选择设计用于对荧光蛋白进行成像的荧光滤光片组合,以最大限度地提高呈现给检测器的发射强度水平,同时减少自发荧光或其他荧光团渗漏的不需要的光子数量。大多数荧光蛋白表现出的宽吸收和发射光谱谱为滤光片提供了广泛的选择,这些滤光片通常针对特定检测系统(人眼、数码相机或光电倍增管)进行优化。本交互式教程旨在识别荧光蛋白成像所需的关键滤光片参数,包括中心波长、带宽区域和二色镜截止波长。

 

 

教程说明

本教程使用叠加在汞弧放电灯的发射光谱上的“光谱图谱”窗口中出现的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的归一化吸收和荧光发射光谱图进行初始化。初始化时窗口中还包括适用于荧光基团的二色镜(分光镜)的波长截止曲线,以及激发滤光片带宽和发射滤光片带宽曲线的建议起点。鼠标光标可用于沿“光谱图”窗口的波长轴拖动灰度带宽边界,以确定最佳位置。每个滤光片控件右侧的双滑块组合或箭头按钮可用于调整带宽,并且可以使用左侧箭头按钮更改中心波长。拖动左侧滑块还会在图形中转换带宽配置文件,而拖动右侧滑块会增加或减少带宽大小。虚拟激发和发射滤光片的当前中心波长和带宽不断更新,并以滑块上方的红色数字显示。

二色镜滑块控制此元素的截止波长曲线位置,并可以使用滑块旁边的复选框打开或关闭。激励和发射滤波器带宽显示也可以通过删除复选标记来禁用。同样,可以通过停用随附的复选框来关闭汞灯光谱图。通过从照明源黄色显示窗口(默认:汞弧灯)上方的框中删除复选标记,可以禁用吸收 (Ab) 和发射 (Em) 光谱曲线。从照明下拉菜单中选择激光源时,基于激光波长处摩尔消光系数的激发效率百分比将显示在照明显示窗口上方的绿色框中。激光线(在“光谱图”窗口中使用近似波长的颜色绘制)可以通过禁用“激光线”复选框来停用。为了在切换探头或照明源列表时保留当前的教程参数(显示的激发和发射滤光片配置文件等),可以启用“保持状态”复选框。可以使用“光谱图”窗口右侧的一组单选按钮以及“选择探针”下拉菜单来选择新的荧光蛋白类别。

表1-荧光蛋白过滤器组合特性

蛋白质
(缩写)
激发
激光
(纳米)
激发
滤波器
CWL / 带宽 (纳米)
二色

截止(纳米)
发射
滤光片
CWL / 带宽 (纳米)
相对
亮度
(EGFP的百分比)
GFP (wt) Argon (488) 450/50 480LP 510/50 48
绿色荧光蛋白
EGFP Argon (488) 470/40 495LP 515/30 100
Emerald Argon (488) 470/40 495LP 515/30 116
Azami Green Argon (488) 470/40 495LP 520/30 121
CopGFP Argon (488) 470/40 490LP 510/30 125
AcGFP Argon (488) 470/40 490LP 510/30 82
ZsGreen Argon (488) 470/30 495LP 520/40 117
蓝色荧光蛋白
EBFP Diode (405) 375/50 405LP 445/50 27
Sapphire Diode (405) 400/50 460LP 515/50 55
T-Sapphire Diode (405) 400/50 460LP 515/50 79
青色荧光蛋白
AmCyan1 Argon (457) 440/40 470LP 500/40 31
ECFP Diode (440) 435/40 460LP 495/50 39
Cerulean Diode (440) 435/40 460LP 500/50 79
CoralHue Cyan Argon (488) 450/50 480LP 505/35 73
黄色荧光蛋白
EYFP Argon (514) 490/40 515LP 540/30 151
PhiYFP Argon (514) 500/45 525LP 555/40 155
Citrine Argon (514) 500/25 515LP 545/40 174
Venus Argon (514) 495/35 515LP 545/40 156
ZsYellow1 He-Ne (543) 500/45 525LP 555/40 25
橙色和红色荧光蛋白
CoralHue Orange He-Ne (543) 525/40 550LP 580/40 92
mOrange He-Ne (543) 525/40 550LP 585/50 146
DsRed He-Ne (543) 540/45 570LP 600/50 176
DsRed2 He-Ne (543) 540/50 570LP 600/40 72
DsRed-Express He-Ne (543) 540/45 570LP 600/50 58
mTangerine Kr-Ar (568) 545/40 570LP 600/40 34
mStrawberry Kr-Ar (568) 550/50 580LP 615/50 78
AsRed2 Kr-Ar (568) 540/40 575LP 620/60 8
mRFP1 He-Ne (594) 560/55 590LP 630/60 37
mCherry He-Ne (594) 560/55 590LP 630/60 47
HcRed1 He-Ne (594) 560/60 595LP 630/50 1
mRaspberry He-Ne (594) 570/60 605LP 645/60 38
HcRed-Tandem He-Ne (594) 570/70 610LP 650/60 19
mPlum He-Ne (594) 570/60 605LP 650/60 12
光学荧光笔荧光蛋白;(N) = 天然 (P) = 光转换
PA-GFP (N) Diode (405) 400/60 465LP 530/50 8
PA-GFP (P) Argon (488) 480/40 505LP 535/40 41
PS-CFP (N) Diode (405) 395/50 430LP 470/60 16
PS-CFP (P) Argon (488) 470/50 500LP 530/40 15
PS-CFP2 (N) Diode (405) 395/50 430LP 470/60 26
PS-CFP2 (P) Argon (488) 470/50 500LP 530/40 32
Kaede (N) Argon (488) 485/40 510LP 535/30 259
Kaede (P) Kr-Ar (568) 540/50 570LP 590/30 59
mEosFP (N) Argon (488) 490/30 510LP 535/30 128
mEosFP (P) Kr-Ar (568) 540/50 570LP 600/40 68
Kindling (N/P) Kr-Ar (568) 560/50 590LP 625/50 12
Dronpa (P) Argon (488) 485/30 505LP 530/30 240
 

 

表1中列出了几种最流行和可能有用的荧光蛋白变体所显示的特性的汇编。除了每种荧光蛋白的通用名称和/或首字母缩略词外,还列出了最佳激光波长线以及激发和发射滤光片带宽和中心波长的建议起点。表中还包括相对亮度和推荐的二色镜参数。计算出的亮度值由摩尔消光系数和量子产率的乘积除以EGFP的值得出。此列表是根据科学和商业文献资源创建的,并不打算全面,而是代表在文献中受到相当关注并可能在研究工作中证明有价值的荧光蛋白衍生物。

用于计算本教程值的吸收和荧光发射光谱是在受控条件下记录的,并且归一化仅用于比较和显示目的。在实际的荧光显微镜研究中,光谱分布可能因环境影响(例如pH、离子浓度和溶剂极性)以及局部探针浓度的波动而变化,因此可能与在实验条件下实际观察到的光谱图不同。

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