数字成像基础

2022-11-04 14:52:43 浏览:125

前言

在过去的五十年里,显微摄影术的主要媒介是胶片,它通过忠实地再现光学显微镜的无数图像,为科学界提供了很好的服务。直到过去十年,电子相机和计算机技术的改进才使数字成像比传统摄影更便宜、更容易使用。

 

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图1-带数码相机的光学显微镜

 

图1所示为透射/反射的尼康Eclipse 600 配备售后帕尔贴冷却数字的光学显微镜 相机能够在较长的累积周期内集成图像。 摄像系统由一个单独的单元控制,该单元与 FireWire 端口位于与 IBM 兼容的个人计算机中。 选择积分周期和其他图像采集参数 通过专有的基于Windows的软件程序。

当相机具有电荷耦合器件(CCD)成像传感器时 在传感器或 IN 上集成模数 (A/D) 转换器 近距离,一般称为数码相机。 因为CCD芯片和所有光学传感器一样,是模拟器件 产生不同电压的流,术语数字仅在以下情况下使用 这些电压在相机中数字化并在计算机中输出 兼容格式。在 12 位数码相机中,模拟信号来自 CCD通过板载A/D转换器以12位深度数字化。 输出是否真的可以解析为4096离散 强度级别(12 位)取决于相机噪声。为了 区分各个强度级别,每个灰阶步骤 应该比相机噪点大2.7倍左右。否则, 例如,无法解决步骤 2982 和 2983 之间的差异 具有任何程度的确定性。一些所谓的12位相机有这样的 很多相机噪声,4096离散步进无法区分。

如果信号一开始是模拟的,为什么要在相机中将其数字化 而不是下游的某个地方?使用 相机内 A/D 转换器:降低噪音,直接与计算机兼容 输出。通常,A/D 离传感器越近,其 噪音水平。来自CCD的低电平模拟信号更容易 比高级数字同行被噪音破坏。在 理想情况下,A/D在CCD芯片上,紧邻 传感器的输出放大器。噪音越低,灰度越大 可以识别电平,因此可以识别的位数越多 有意义地用于强度测量。

 

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图 2 - 带电耦合器件架构

 

与模拟相机相比,数码相机有几个优点。数码相机产生与隔行扫描不同的逐行扫描输出 摄像机产生的信号。隔行扫描视频的数字化 信号需要专门的捕获板和帧缓冲器。这 逐行扫描相机的输出可以直接连接到 计算机(例如,IEEE-1394、RS-422 或 SCSI 接口)。在渐进式 扫描相机,曝光时首先获取整个图像 时间(也称为积分周期),然后读出,行由 从图像顶部到底部的线条。现代高速 放大器和 A/D 转换器允许数码相机产生 全帧图像的速率等于或超过视频帧速率。

数码相机的另一个优点是输出完美 适合计算机显示器的格式。因为信号已经 数字化,图像存储,处理和显示都非常出色 与使用视频信号的类似操作相比,进行了简化。 处理印刷品,幻灯片和底片的困难是 在数码摄影中被淘汰,因为现在许多科学期刊 接受数字图像文件。结果是提高了质量 已发布的图像和演示文稿中显示的图像。数字化图像 可以处理,压缩,通过互联网传输,粘贴到 文档或调到海报中。

CCD架构

数码相机中常用的两种CCD设计:隔行 传输和帧传输。隔行传输 CCD 包含 电荷转移通道位于每个光电二极管旁边,以便累积 电荷可以高效快速地转移到它们身上(图 2)。 行间传输传感器也可以通过以下方式以电子方式“关闭”关闭 转储存储的费用,而不是将其转移到传输中 渠道。帧传输CCD使用两部分传感器,其中 上半部分被不透光面罩覆盖,用作储物 地区。允许光线落在未覆盖的部分上,并且 然后,累积的电荷迅速转移到标记的存储中 地区。当信号集成在光敏上时 部分传感器,将存储的电荷读出。

互动教程-全画幅CCD操作

全帧电荷耦合器件(CCD)的读出方案。

两种类型的彩色数码相机用于科学 应用-带有波长选择滤光片的单个CCD相机或 三传感器摄像头。两者都使用过滤器来产生红色,绿色和蓝色 视野的版本。单传感器相机使用滤镜 轮式或液晶可调谐滤波器,用于获取红色、绿色和 蓝色图像顺序。三传感器相机具有分束功能 棱镜和微调滤光片,使每个传感器能够成像适当的 颜色并同时获取所有三个图像。总是,颜色 相机的灵敏度不如黑白相机,因为 附加的分束和波长选择组件。 在某些应用中,特别是免疫荧光,损失 灵敏度被捕获多个波长的能力所抵消 同时或快速连续。此外,一些彩色相机 通过对角偏移红色、绿色和 蓝色传感器,每个传感器为三分之一像素,从而使数量增加三倍 获得的样品。

尽管CCD相机制造商和用户经常提到每个 光电二极管作为像素(图片元素),没有必要 像素的数量和位置之间的对应关系 传感器以及计算机显示器或打印机中的传感器。然而, 显示器或打印机分辨率应始终至少与此一样高 的传感器。

量子效率

量子效率(QE)是指入射光子的百分比 检测到的。(供参考,我们明文的QE 视力约为3%;图3)。硅光电二极管,基本 CCD的构建模块,在广泛的范围内具有高QE(80%) 可见光谱范围和近红外光谱,如图所示 在图 3 中。CCD的光谱灵敏度低于CCD的光谱灵敏度 简单的硅光电二极管,因为CCD具有电荷转移通道 在其表面上,将峰值量化宽松降至约40%。

 

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图3-CCD光谱灵敏度

 

近日,一些科学级的渠道透明度 CCDs已经增加,蓝绿范围内的QE已经提高到 近70%。表面通道的损耗完全 在背照式CCD中消除。在这个设计中,光线落下 在CCD背面通过蚀刻变薄的区域 直到它是透明的。高达90%的量子效率可以 实现。然而,向后变薄会导致微妙的、相对的 迄今为止,昂贵的传感器仅用于 科学级慢扫描CCD相机。

CCD相机中的噪声

CCD相机中有两个主要的噪声源 - 暗噪声和 读出噪声。尽管在 过去几年在室温下减少CCD暗噪声, 每降低20°C,冷却芯片可进一步降低10倍的噪音。 暗噪点最明显,表现为图像中的“热”像素(白点) 使用室温CCD相机在积分周期为4 或 5 秒。冷却到 0° C 通常足以集成 周期长达 30 秒。需要长时间曝光的实验 (例如,化学发光)需要更低的传感器温度。数字 相机有冷却或非冷却版本。

 

图4 - CCD噪声源

 

数码相机的噪声源各不相同,几种常见的类型是 图4中以示波器迹线表示。光子噪声,暗 电流、固定图案噪声和光响应不均匀性是 在 CCD 本身上产生,同时复位噪声、I/F 噪声和 量化噪声发生在放大和转换过程中 模拟信号到数字输出。读出噪声在 CCD芯片上的放大器,用于转换每个存储的电荷 光电二极管(即像素)转换成模拟电压,通过A/D量化 转换。读出噪声可能被视为必须支付的“通行费” 用于读取存储的费用。如果此收费减少,则大小 在过去几年中稳定到5-10个电子/像素,因为 改进CCD设计、时钟和采样方法。读出 噪声与读出速度成正比。去的成本 速度越快,噪声越多,因此电压的不确定性就越大 确定和较低的分辨率位数。这就是为什么 慢速扫描相机的读出噪声通常比速度快的相机低 输出检测器,并具有更多的有用位。数字 Came4RAS的范围从每秒8帧的8-12位深度到30位的那些 以每秒 1-2 帧的速度输出到 16 位深度。

互动教程 - CCD噪声源

回顾与数字成像相关的噪声源类型。

速度/读出噪声问题的一种解决方案是使用 大型CCD上的多个输出放大器(抽头)。而不是阅读 通过一个输出放大器从整个CCD存储的电荷, 传感器分为四个或八个部分,每个部分都有自己的 放大器。图像被部分读出,然后拼接在一起 软件的速率为每秒几帧。所需的速度和 每个放大器的相关噪声也相应降低。

信噪比

由于光子随机到达传感器表面,因此它们的数量 随泊松统计所描述的相等的噪声波动 到检测到的光子数的平方根。当然,相机 噪声增加了这种光子统计噪声,并进一步降低了 信噪比。数码相机可以达到的最高信噪比是 最大累积电荷(全阱容量)的平方根。 对图像中任何均匀区域的信噪比进行简单估计是 感兴趣区域的平均强度除以标准 该区域强度的偏差。

数码相机中有多少像素才足够?

CCD的分辨率是光电二极管数量的函数 以及它们相对于投影图像的大小。1000 x CCD 阵列 1000个光电二极管现在在数码相机中司空见惯。趋势 消费级和科学级CCD制造适用于传感器尺寸 减少,一些CCD光电二极管小至4 x 4微米。从 采样理论,只能实现物体的足够分辨率 如果每个可分辨单元至少制作两个样本。(许多用户 每个可分辨单元最好有三个样本,以确保足够的采样)。

表1-光学显微镜中最大分辨率的像素尺寸要求

物镜
(数值孔径)
分辨率
限制
(微米)
CCD
上的投影
尺寸(微米)
所需像素
尺寸
(微米)
4x (0.20) 1.5 5.8 2.9
10x (0.45) 0.64 6.4 3.2
20x (0.75) 0.39 7.7 3.9
40x (0.85) 0.34 13.6 6.8
40x (1.30) 0.22 8.9 4.5
60x (0.95) 0.31 18.3 9.2
60x (1.40) 0.21 12.4 6.2
100x (0.90) 0.32 32.0 16.0
100x (1.25) 0.23 23.0 11.5
100x (1.40) 0.21 21.0 10.5

在落射荧光显微镜中,阿贝衍射极限为 550纳米处的1.4数值孔径透镜为0.22微米。对于一个 100倍物镜,衍射极限光斑的投影尺寸 CCD的表面是22微米。光电二极管尺寸为 11 x 11 微米只会允许光学和电子分辨率 匹配,首选7 x 7微米光电二极管。像素大小 介绍了光学显微镜对最高分辨率的要求 表1中的物镜放大倍率范围为4倍至100倍。与一个 100倍物镜,无需额外放大倍率,1000 x 1000 CCD,带7 x 7 微米光电二极管可捕获 70 x 70 微米的视场 在对象平面中。当图像的大小投影到 CCCD适当调整以适当采样,数量更大 CCD中的光电二极管会增加视场,而不是分辨率。 各种输出设备的分辨率要求可能需要 传感器处的过采样,以便最终产品(例如,幻灯片、打印 或海报)在最终尺寸下具有足够的分辨率。

动态范围

场景内动态范围表示有用的强度范围 可以在同一视场中同时检测。场景间 动态范围是可以容纳的强度范围,在以下情况下 探测器增益、积分时间、镜头光圈或其他变量是 针对不同的视野进行了调整。虽然CCD上的传感器很小 从分辨率的角度来看是可取的,它们限制了动态范围 的设备。CCD的全阱容量约为CCD的1000倍 每个光电二极管的横截面积。因此,具有 7 x7 微米的 CCD 像素应具有49000个电子或空穴的全阱容量。(一 空穴是电子来自的硅区域, 构成同样有效和可用的检测光子测量。 使用术语电子,尽管大多数CCD读出的数量 产生的空穴而不是电子。由于CCD没有固有的 增益,每个检测到的光子累积一个电子 - 空穴对。

CCD的动态范围通常定义为全阱 容量除以摄像机噪声。摄像头噪声的计算公式为: 黑暗和读出的平方和的平方根 噪声。因此,49000个电子全阱容量的动态范围 具有10个电子的读出噪声和可忽略不计的暗噪声的CCD是 大约 4900,对应于 12 位。但是,数字化如果 这种相机以12位深度输出意味着49000个电子是 分为 4096 个 A/D 单元,每个单元包含 12 个电子 (49000/4096)。 由于噪声为10个电子,每个灰度步长仅为1.2倍 噪音,无法区分。10 位的数字化将 导致每个A / D单位为49个电子,大约是噪声的五倍 水平,然后可以区分 1024 个灰度级别中的每一个。一个 将位深度与灰度级别和动态范围相关的表格(在 分贝)如表2所示,其涵盖的范围为5 数量级。

控制速度、有效像素大小和视场

慢扫描数码相机可以控制读出率, 构成传感器的像素的有效尺寸和 视野。科学级CCD相机通常提供两个或更多 读出率,以便速度与噪声进行权衡。这 一个像素的有效尺寸,在许多慢扫描数码相机中可以 通过分箱增加,该过程中的电荷来自集群 相邻的光电二极管被汇集并被视为来自更大的光电二极管 探测器。

表 2- 带电耦合器件的动态范围

位深度 灰度 水平 动态范围 (分贝)
1 2 6 dB
2 4 12 dB
3 8 18dB
4 16 24 dB
5 32 30 dB
6 64 36 dB
7 128 42 dB
8 256 48 dB
9 512 54 dB
10 1,024 60 dB
11 2,048 66 dB
12 4,096 72 dB
13 8,192 78 dB
14 16,384 84 dB
16 65,536 96 dB
18 262,144 108 dB
20 1,048,576 120 dB

当光照水平非常低且光子很少时,像素合并很有用 检测到,因为它使调查人员能够交换空间分辨率 灵敏度。此外,大多数慢扫描CCD相机允许 感兴趣区域的读出,其中图像的选定部分可以 显示并丢弃剩余的累积费用。这 成帧率通常与 提交视图。例如,传感器尺寸为 1000 x 1000 的 CCD 和 10帧/秒的输出速率可以产生100帧/秒,如果读出 区域减少到 100 x 100 个二极管。通过权衡视野和 取景率,调查员可以调整到更广泛的范围 实验环境比固定的 取景率相机。

增强型数码相机

一些制造商现在提供配备 用于极低光水平成像的图像增强器。这些有一个 靠近微通道板电子的光电阴极 乘法器和磷光输出屏幕(参见图5中的插图)。最新一代器件中的光电阴极 在蓝绿端具有高量子效率(高达50%) 的频谱。增强器增益可在很宽的范围内调节 典型最大值约为 80000。来自 光电阴极以及来自 微通道板将增强型CCD相机中的信噪比降低到以下 慢速扫描CCD。强化 CCD 的分辨率取决于 增强器和CCD都有效,但通常受到 增压器微通道板几何形状约为 75% 仅 CCD。

 

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图 5- 聚焦接近图像增强器

增强型数码相机的动态(和场景内)降低 动态)范围与慢扫描相机相比,大多数仅限于 10 位分辨率。增强器增益可快速且可重复 更改以适应场景亮度的变化,从而 增加场景间动态范围。

交互式教程 - 以接近为中心的图像增强器

用微通道板和光电阴极进行光放大。

事实上,由于图像增强器可以门控,即关闭或 在几纳秒内,相对明亮的物体可以通过以下方式可视化 减少“开启”时间。门控增强型数码相机是 大多数时间分辨荧光显微镜应用都需要 因为检波器增益必须在高频下调制 与光源同步。由于光通量低 活细胞需要增强型CCD相机 用于研究动态事件和比率成像。

选择合适的相机

没有单一的检测器可以满足荧光的所有要求 显微镜检查,因此研究者必须妥协。曝光时间通常 关键参数。当有时间进行映像集成时,a 慢扫描CCD相机的性能优于增强型相机 领域,很大程度上是因为其更高的量子效率和更低的 噪声。冷却总是可以提高数码相机的性能,尽管 当积分时间很少时,差异可能不明显 秒或更短,数字化深度为 8-12 位。为 涉及数字反卷积的应用,首选的检测器是 冷却,科学级,慢扫描相机,能够产生 高分辨率、14-16 位图像。光电二极管尺寸很重要;一些CCD 像素太小,积分周期可能必须 限制以避免电荷存储井饱和,结果 动态范围和峰值信噪比可能会受到影响。如果事件 正在调查是快速的,但可以精确触发,然后 在突发或高速模式下运行的慢速扫描CCD可能是合适的。 但是,当事件不容易预测并且样本必须 在低入射光通量下连续监测,增强型CCD 是首选的探测器。因此,单分子 荧光成像使用增强型数码相机。

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图6-小鼠肠薄切片(荧光/相衬)

图6所示的显微照片是组合 小鼠薄片的落射荧光/相衬图像 肠用几个荧光发色团三重染色。尼康 使用了Eclipse E600,类似于图1所示的Eclipse E600 使用尼康DXM 1200数码相机记录图6中的图像。 当需要常规组织学标本的彩色图像时 三CCD相机比廉价的单传感器相机更可取 带有一体式彩色遮罩。高分辨率、单传感器CCD相机 配备可拆卸的红绿蓝液晶滤光片 事实证明,明场和荧光显微镜都非常有用。

展望

CMOS(补充金属)性能的最新改进 氧化物半导体)相机预示着未来潜在的重要角色 用于荧光显微镜中的这些设备。CMOS相机具有 与集成中的每个光电二极管相关联的放大器和数字化仪 片上格式。结果是低成本、紧凑、多功能的探测器 结合硅检测的优点,没有 电荷转移。CMOS传感器允许再次操纵单个 光电二极管、感兴趣区域读数、高速采样、电子 计算机界面的快门和曝光格式。直到 最近,他们遭受了与 切换和采样伪影,但这些问题现在正在 迅速解决。它们很可能会取代数字CCD 相机在不久的将来将用于许多科学应用。

技术专题

作          者: 泮桥成像光电商城

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