前言
在过去的五十年里，显微摄影术的主要媒介是胶片，它通过忠实地再现光学显微镜的无数图像，为科学界提供了很好的服务。直到过去十年，电子相机和计算机技术的改进才使数字成像比传统摄影更便宜、更容易使用。
图1-带数码相机的光学显微镜
图1所示为透射/反射的尼康Eclipse 600 配备售后帕尔贴冷却数字的光学显微镜 相机能够在较长的累积周期内集成图像。 摄像系统由一个单独的单元控制，该单元与 FireWire 端口位于与 IBM 兼容的个人计算机中。 选择积分周期和其他图像采集参数 通过专有的基于Windows的软件程序。
当相机具有电荷耦合器件（CCD）成像传感器时 在传感器或 IN 上集成模数 （A/D） 转换器 近距离，一般称为数码相机。 因为CCD芯片和所有光学传感器一样，是模拟器件 产生不同电压的流，术语数字仅在以下情况下使用 这些电压在相机中数字化并在计算机中输出 兼容格式。在 12 位数码相机中，模拟信号来自 CCD通过板载A/D转换器以12位深度数字化。 输出是否真的可以解析为4096离散 强度级别（12 位）取决于相机噪声。为了 区分各个强度级别，每个灰阶步骤 应该比相机噪点大2.7倍左右。否则， 例如，无法解决步骤 2982 和 2983 之间的差异 具有任何程度的确定性。一些所谓的12位相机有这样的 很多相机噪声，4096离散步进无法区分。
如果信号一开始是模拟的，为什么要在相机中将其数字化 而不是下游的某个地方？使用 相机内 A/D 转换器：降低噪音，直接与计算机兼容 输出。通常，A/D 离传感器越近，其 噪音水平。来自CCD的低电平模拟信号更容易 比高级数字同行被噪音破坏。在 理想情况下，A/D在CCD芯片上，紧邻 传感器的输出放大器。噪音越低，灰度越大 可以识别电平，因此可以识别的位数越多 有意义地用于强度测量。
图 2 - 带电耦合器件架构
与模拟相机相比，数码相机有几个优点。数码相机产生与隔行扫描不同的逐行扫描输出 摄像机产生的信号。隔行扫描视频的数字化 信号需要专门的捕获板和帧缓冲器。这 逐行扫描相机的输出可以直接连接到 计算机（例如，IEEE-1394、RS-422 或 SCSI 接口）。在渐进式 扫描相机，曝光时首先获取整个图像 时间（也称为积分周期），然后读出，行由 从图像顶部到底部的线条。现代高速 放大器和 A/D 转换器允许数码相机产生 全帧图像的速率等于或超过视频帧速率。
数码相机的另一个优点是输出完美 适合计算机显示器的格式。因为信号已经 数字化，图像存储，处理和显示都非常出色 与使用视频信号的类似操作相比，进行了简化。 处理印刷品，幻灯片和底片的困难是 在数码摄影中被淘汰，因为现在许多科学期刊 接受数字图像文件。结果是提高了质量 已发布的图像和演示文稿中显示的图像。数字化图像 可以处理，压缩，通过互联网传输，粘贴到 文档或调到海报中。
CCD架构
数码相机中常用的两种CCD设计：隔行 传输和帧传输。隔行传输 CCD 包含 电荷转移通道位于每个光电二极管旁边，以便累积 电荷可以高效快速地转移到它们身上（图 2）。 行间传输传感器也可以通过以下方式以电子方式“关闭”关闭 转储存储的费用，而不是将其转移到传输中 渠道。帧传输CCD使用两部分传感器，其中 上半部分被不透光面罩覆盖，用作储物 地区。允许光线落在未覆盖的部分上，并且 然后，累积的电荷迅速转移到标记的存储中 地区。当信号集成在光敏上时 部分传感器，将存储的电荷读出。
互动教程-全画幅CCD操作
全帧电荷耦合器件（CCD）的读出方案。
两种类型的彩色数码相机用于科学 应用-带有波长选择滤光片的单个CCD相机或 三传感器摄像头。两者都使用过滤器来产生红色，绿色和蓝色 视野的版本。单传感器相机使用滤镜 轮式或液晶可调谐滤波器，用于获取红色、绿色和 蓝色图像顺序。三传感器相机具有分束功能 棱镜和微调滤光片，使每个传感器能够成像适当的 颜色并同时获取所有三个图像。总是，颜色 相机的灵敏度不如黑白相机，因为 附加的分束和波长选择组件。 在某些应用中，特别是免疫荧光，损失 灵敏度被捕获多个波长的能力所抵消 同时或快速连续。此外，一些彩色相机 通过对角偏移红色、绿色和 蓝色传感器，每个传感器为三分之一像素，从而使数量增加三倍 获得的样品。
尽管CCD相机制造商和用户经常提到每个 光电二极管作为像素（图片元素），没有必要 像素的数量和位置之间的对应关系 传感器以及计算机显示器或打印机中的传感器。然而， 显示器或打印机分辨率应始终至少与此一样高 的传感器。
量子效率
量子效率（QE）是指入射光子的百分比 检测到的。（供参考，我们明文的QE 视力约为3%;图3）。硅光电二极管，基本 CCD的构建模块，在广泛的范围内具有高QE（80%） 可见光谱范围和近红外光谱，如图所示 在图 3 中。CCD的光谱灵敏度低于CCD的光谱灵敏度 简单的硅光电二极管，因为CCD具有电荷转移通道 在其表面上，将峰值量化宽松降至约40%。
图3-CCD光谱灵敏度
近日，一些科学级的渠道透明度 CCDs已经增加，蓝绿范围内的QE已经提高到 近70%。表面通道的损耗完全 在背照式CCD中消除。在这个设计中，光线落下 在CCD背面通过蚀刻变薄的区域 直到它是透明的。高达90%的量子效率可以 实现。然而，向后变薄会导致微妙的、相对的 迄今为止，昂贵的传感器仅用于 科学级慢扫描CCD相机。
CCD相机中的噪声
CCD相机中有两个主要的噪声源 - 暗噪声和 读出噪声。尽管在 过去几年在室温下减少CCD暗噪声， 每降低20°C，冷却芯片可进一步降低10倍的噪音。 暗噪点最明显，表现为图像中的“热”像素（白点） 使用室温CCD相机在积分周期为4 或 5 秒。冷却到 0° C 通常足以集成 周期长达 30 秒。需要长时间曝光的实验 （例如，化学发光）需要更低的传感器温度。数字 相机有冷却或非冷却版本。
图4 - CCD噪声源
数码相机的噪声源各不相同，几种常见的类型是 图4中以示波器迹线表示。光子噪声，暗 电流、固定图案噪声和光响应不均匀性是 在 CCD 本身上产生，同时复位噪声、I/F 噪声和 量化噪声发生在放大和转换过程中 模拟信号到数字输出。读出噪声在 CCD芯片上的放大器，用于转换每个存储的电荷 光电二极管（即像素）转换成模拟电压，通过A/D量化 转换。读出噪声可能被视为必须支付的“通行费” 用于读取存储的费用。如果此收费减少，则大小 在过去几年中稳定到5-10个电子/像素，因为 改进CCD设计、时钟和采样方法。读出 噪声与读出速度成正比。去的成本 速度越快，噪声越多，因此电压的不确定性就越大 确定和较低的分辨率位数。这就是为什么 慢速扫描相机的读出噪声通常比速度快的相机低 输出检测器，并具有更多的有用位。数字 Came4RAS的范围从每秒8帧的8-12位深度到30位的那些 以每秒 1-2 帧的速度输出到 16 位深度。
互动教程 - CCD噪声源
回顾与数字成像相关的噪声源类型。
速度/读出噪声问题的一种解决方案是使用 大型CCD上的多个输出放大器（抽头）。而不是阅读 通过一个输出放大器从整个CCD存储的电荷， 传感器分为四个或八个部分，每个部分都有自己的 放大器。图像被部分读出，然后拼接在一起 软件的速率为每秒几帧。所需的速度和 每个放大器的相关噪声也相应降低。
信噪比
由于光子随机到达传感器表面，因此它们的数量 随泊松统计所描述的相等的噪声波动 到检测到的光子数的平方根。当然，相机 噪声增加了这种光子统计噪声，并进一步降低了 信噪比。数码相机可以达到的最高信噪比是 最大累积电荷（全阱容量）的平方根。 对图像中任何均匀区域的信噪比进行简单估计是 感兴趣区域的平均强度除以标准 该区域强度的偏差。
数码相机中有多少像素才足够？
CCD的分辨率是光电二极管数量的函数 以及它们相对于投影图像的大小。1000 x CCD 阵列 1000个光电二极管现在在数码相机中司空见惯。趋势 消费级和科学级CCD制造适用于传感器尺寸 减少，一些CCD光电二极管小至4 x 4微米。从 采样理论，只能实现物体的足够分辨率 如果每个可分辨单元至少制作两个样本。（许多用户 每个可分辨单元最好有三个样本，以确保足够的采样）。
表1-光学显微镜中最大分辨率的像素尺寸要求
| 物镜 （数值孔径） |
分辨率 限制 （微米） |
CCD 上的投影 尺寸（微米） |
所需像素 尺寸 （微米） |
|---|---|---|---|
| 4x (0.20) | 1.5 | 5.8 | 2.9 |
| 10x (0.45) | 0.64 | 6.4 | 3.2 |
| 20x (0.75) | 0.39 | 7.7 | 3.9 |
| 40x (0.85) | 0.34 | 13.6 | 6.8 |
| 40x (1.30) | 0.22 | 8.9 | 4.5 |
| 60x (0.95) | 0.31 | 18.3 | 9.2 |
| 60x (1.40) | 0.21 | 12.4 | 6.2 |
| 100x (0.90) | 0.32 | 32.0 | 16.0 |
| 100x (1.25) | 0.23 | 23.0 | 11.5 |
| 100x (1.40) | 0.21 | 21.0 | 10.5 |
在落射荧光显微镜中，阿贝衍射极限为 550纳米处的1.4数值孔径透镜为0.22微米。对于一个 100倍物镜，衍射极限光斑的投影尺寸 CCD的表面是22微米。光电二极管尺寸为 11 x 11 微米只会允许光学和电子分辨率 匹配，首选7 x 7微米光电二极管。像素大小 介绍了光学显微镜对最高分辨率的要求 表1中的物镜放大倍率范围为4倍至100倍。与一个 100倍物镜，无需额外放大倍率，1000 x 1000 CCD，带7 x 7 微米光电二极管可捕获 70 x 70 微米的视场 在对象平面中。当图像的大小投影到 CCCD适当调整以适当采样，数量更大 CCD中的光电二极管会增加视场，而不是分辨率。 各种输出设备的分辨率要求可能需要 传感器处的过采样，以便最终产品（例如，幻灯片、打印 或海报）在最终尺寸下具有足够的分辨率。
动态范围
场景内动态范围表示有用的强度范围 可以在同一视场中同时检测。场景间 动态范围是可以容纳的强度范围，在以下情况下 探测器增益、积分时间、镜头光圈或其他变量是 针对不同的视野进行了调整。虽然CCD上的传感器很小 从分辨率的角度来看是可取的，它们限制了动态范围 的设备。CCD的全阱容量约为CCD的1000倍 每个光电二极管的横截面积。因此，具有 7 x7 微米的 CCD 像素应具有49000个电子或空穴的全阱容量。（一 空穴是电子来自的硅区域， 构成同样有效和可用的检测光子测量。 使用术语电子，尽管大多数CCD读出的数量 产生的空穴而不是电子。由于CCD没有固有的 增益，每个检测到的光子累积一个电子 - 空穴对。
CCD的动态范围通常定义为全阱 容量除以摄像机噪声。摄像头噪声的计算公式为： 黑暗和读出的平方和的平方根 噪声。因此，49000个电子全阱容量的动态范围 具有10个电子的读出噪声和可忽略不计的暗噪声的CCD是 大约 4900，对应于 12 位。但是，数字化如果 这种相机以12位深度输出意味着49000个电子是 分为 4096 个 A/D 单元，每个单元包含 12 个电子 （49000/4096）。 由于噪声为10个电子，每个灰度步长仅为1.2倍 噪音，无法区分。10 位的数字化将 导致每个A / D单位为49个电子，大约是噪声的五倍 水平，然后可以区分 1024 个灰度级别中的每一个。一个 将位深度与灰度级别和动态范围相关的表格（在 分贝）如表2所示，其涵盖的范围为5 数量级。
控制速度、有效像素大小和视场
慢扫描数码相机可以控制读出率， 构成传感器的像素的有效尺寸和 视野。科学级CCD相机通常提供两个或更多 读出率，以便速度与噪声进行权衡。这 一个像素的有效尺寸，在许多慢扫描数码相机中可以 通过分箱增加，该过程中的电荷来自集群 相邻的光电二极管被汇集并被视为来自更大的光电二极管 探测器。
表 2- 带电耦合器件的动态范围
| 位深度 | 灰度 水平 | 动态范围 （分贝） |
|---|---|---|
| 1 | 2 | 6 dB |
| 2 | 4 | 12 dB |
| 3 | 8 | 18dB |
| 4 | 16 | 24 dB |
| 5 | 32 | 30 dB |
| 6 | 64 | 36 dB |
| 7 | 128 | 42 dB |
| 8 | 256 | 48 dB |
| 9 | 512 | 54 dB |
| 10 | 1,024 | 60 dB |
| 11 | 2,048 | 66 dB |
| 12 | 4,096 | 72 dB |
| 13 | 8,192 | 78 dB |
| 14 | 16,384 | 84 dB |
| 16 | 65,536 | 96 dB |
| 18 | 262,144 | 108 dB |
| 20 | 1,048,576 | 120 dB |
当光照水平非常低且光子很少时，像素合并很有用 检测到，因为它使调查人员能够交换空间分辨率 灵敏度。此外，大多数慢扫描CCD相机允许 感兴趣区域的读出，其中图像的选定部分可以 显示并丢弃剩余的累积费用。这 成帧率通常与 提交视图。例如，传感器尺寸为 1000 x 1000 的 CCD 和 10帧/秒的输出速率可以产生100帧/秒，如果读出 区域减少到 100 x 100 个二极管。通过权衡视野和 取景率，调查员可以调整到更广泛的范围 实验环境比固定的 取景率相机。
增强型数码相机
一些制造商现在提供配备 用于极低光水平成像的图像增强器。这些有一个 靠近微通道板电子的光电阴极 乘法器和磷光输出屏幕（参见图5中的插图）。最新一代器件中的光电阴极 在蓝绿端具有高量子效率（高达50%） 的频谱。增强器增益可在很宽的范围内调节 典型最大值约为 80000。来自 光电阴极以及来自 微通道板将增强型CCD相机中的信噪比降低到以下 慢速扫描CCD。强化 CCD 的分辨率取决于 增强器和CCD都有效，但通常受到 增压器微通道板几何形状约为 75% 仅 CCD。
图 5- 聚焦接近图像增强器
增强型数码相机的动态（和场景内）降低 动态）范围与慢扫描相机相比，大多数仅限于 10 位分辨率。增强器增益可快速且可重复 更改以适应场景亮度的变化，从而 增加场景间动态范围。
交互式教程 - 以接近为中心的图像增强器
用微通道板和光电阴极进行光放大。
事实上，由于图像增强器可以门控，即关闭或 在几纳秒内，相对明亮的物体可以通过以下方式可视化 减少“开启”时间。门控增强型数码相机是 大多数时间分辨荧光显微镜应用都需要 因为检波器增益必须在高频下调制 与光源同步。由于光通量低 活细胞需要增强型CCD相机 用于研究动态事件和比率成像。
选择合适的相机
没有单一的检测器可以满足荧光的所有要求 显微镜检查，因此研究者必须妥协。曝光时间通常 关键参数。当有时间进行映像集成时，a 慢扫描CCD相机的性能优于增强型相机 领域，很大程度上是因为其更高的量子效率和更低的 噪声。冷却总是可以提高数码相机的性能，尽管 当积分时间很少时，差异可能不明显 秒或更短，数字化深度为 8-12 位。为 涉及数字反卷积的应用，首选的检测器是 冷却，科学级，慢扫描相机，能够产生 高分辨率、14-16 位图像。光电二极管尺寸很重要;一些CCD 像素太小，积分周期可能必须 限制以避免电荷存储井饱和，结果 动态范围和峰值信噪比可能会受到影响。如果事件 正在调查是快速的，但可以精确触发，然后 在突发或高速模式下运行的慢速扫描CCD可能是合适的。 但是，当事件不容易预测并且样本必须 在低入射光通量下连续监测，增强型CCD 是首选的探测器。因此，单分子 荧光成像使用增强型数码相机。
图6-小鼠肠薄切片（荧光/相衬）
图6所示的显微照片是组合 小鼠薄片的落射荧光/相衬图像 肠用几个荧光发色团三重染色。尼康 使用了Eclipse E600，类似于图1所示的Eclipse E600 使用尼康DXM 1200数码相机记录图6中的图像。 当需要常规组织学标本的彩色图像时 三CCD相机比廉价的单传感器相机更可取 带有一体式彩色遮罩。高分辨率、单传感器CCD相机 配备可拆卸的红绿蓝液晶滤光片 事实证明，明场和荧光显微镜都非常有用。
展望
CMOS（补充金属）性能的最新改进 氧化物半导体）相机预示着未来潜在的重要角色 用于荧光显微镜中的这些设备。CMOS相机具有 与集成中的每个光电二极管相关联的放大器和数字化仪 片上格式。结果是低成本、紧凑、多功能的探测器 结合硅检测的优点，没有 电荷转移。CMOS传感器允许再次操纵单个 光电二极管、感兴趣区域读数、高速采样、电子 计算机界面的快门和曝光格式。直到 最近，他们遭受了与 切换和采样伪影，但这些问题现在正在 迅速解决。它们很可能会取代数字CCD 相机在不久的将来将用于许多科学应用。
