前言
即使对于经验丰富的显微镜学家来说，在光学显微镜中获取精确的色彩平衡图像也是一个挑战，无论他们是使用传统的照相胶片乳剂还是更新的固态数码相机系统。电子图像捕获技术的利用依赖于与传统的基于胶片的显微摄影相同的光特性，但是执行白平衡调整以实现色彩平衡的能力是电子图像传感器的独特功能，对于寻求从显微镜捕获数字图像的研究人员来说，它根本不直观。
图1 - 3200K和5500k照明下的白平衡校正
当将捕获的数字图像与通过显微镜目镜观察到的图像或在计算机显示器上实时观看的图像进行批判性比较时，颜色变化通常非常惊人，并且试图调和两者之间的差异可能会令人沮丧。造成这种差异的一个因素是，在成像过程中，人类视觉系统会下意识地适应成像条件的变化，并且通常在不同的观看环境中记录图像并评估静态版本之前，通常不会意识到色彩再现问题。
图1所示是在不同照明色温条件下记录的同一显微镜视场的一系列数字图像。该标本是贴壁的印度Muntjac鹿皮肤成纤维细胞的单层培养物，在相对较低的（波长的二十分之一）偏置延迟下以微分干涉对比（DIC）观察。在目镜中，当调整Nomarski棱镜以实现图1所示的光程差时，细胞培养物呈现中性灰色，并在光路中添加颜色转换滤光片，将卤钨灯的色温从3200K提高到约5500K（日光值）。
如果没有颜色转换滤光片，图1中的DIC样品呈现中性灰色，但通过显微镜目镜观察时表现出明显的全局黄色色调，这是白炽灯照明的特征。如果未激活数码相机白平衡功能并将其应用于当前显微镜配置，则在这些条件下拍摄的图像也会出现整体黄色色偏（图1（a））。在光路中插入颜色转换滤光片会使图像在目镜中呈现轻微的蓝色调，而未经白平衡校正捕获的相应数字图像会保持或放大这种色偏（图1（c））。将白平衡算法应用于使用钨丝灯或日光平衡照明拍摄的图像可消除由于色温效应引起的阴影，如图1（b）所示。请注意，该算法使用不同的颜色校正值来平衡图像的色调质量，具体取决于照明色温。钨丝灯照明需要增加蓝色和减少红色的校正值，而日光照明则相反。
使用数码相机系统与光学显微镜耦合获得的图像实现适当的色彩平衡取决于许多因素，首先是建立正确的照明条件和精确的显微镜光学对准，最后是图像捕获阶段。白平衡调整在获得所需图像方面的作用尤为重要，此控制功能可用于捕获标本最忠实的再现，或有意修改标本的表示形式，以校正由制备伪像产生的不需要的色偏。
从概念上讲，需要对白平衡进行粗略调整，以使图像传感器响应进入一般照明条件的适当范围（类似于选择胶片类别），而精细修改有点类似于在基于胶片的摄影中使用色彩补偿滤光片。即使照明源和检测器响应匹配，通过显微镜的光通常也会被标本和光路中的任何其他组件所改变，这在某种程度上是不可预测的。因此，获得的最终图像的色彩平衡可能与期望的结果不同。了解不同的标本（也许是标本的局部区域）对成像光产生独特的影响至关重要。因此，如果需要准确的色彩平衡，则必须仔细控制白平衡调整等变量。
色彩平衡图像的一般概念
光学显微镜中的图像形成基于光的基本特性，包括产生视觉感知颜色的强度和光谱特性，以及相关的色温值。色温的属性可以相对于标准参考照明源精确定义，并且可以在仪器上测量，但在预测给定成像情况下每个标本的渲染方式方面并不可靠。此外，具有相同色温的光源在相似条件下观察时可能具有显着不同的光谱组成，并产生截然不同的图像。使这种情况更加复杂的是，对比度增强辅助组件可能会在显微镜光学系统中引入多种效果。明场、暗场、相衬、DIC、偏振光、霍夫曼调制对比度和荧光照明都对色彩平衡校正表现出不同的表现，这通常必须通过单独考虑标本和照明条件来解决。
图2 - 对比度增强技术的色彩平衡错误
图2所示是在不同照明色温和对比度增强方法的条件下捕获的几张数字图像。图2（a）显示了在卤钨照明中人睾丸癌（精原细胞瘤）的伊红和苏木精染色薄切片。请注意，与色彩平衡适当的图像相比，整体黄色色偏遍布整个图像，并使染色部分变色（如图7（b）所示）。这是明场显微镜中未将日光颜色转换滤光片插入光路时发生的常见错误。如图2（b）所示，在不校正数码相机白平衡的情况下，在光路中添加蓝色日光滤光片可能会导致数字图像整体呈蓝色调。这张单层培养中活的HeLa细胞图像揭示了相机色彩平衡不正确时出现的蓝色色偏。将白平衡算法应用于捕获软件将以显微镜目镜中观察到的灰度值呈现图像。
当显微镜照明与日光色温不平衡且相机系统未正确调整白平衡时，使用其他对比度增强技术获得的图像会产生类似的问题。在图2（c）、2（d）和2（e）中，分别用微分干涉对比度（DIC）、偏振光和霍夫曼调制对比度拍摄的图像的色彩平衡值都转移到较暖（黄色）的色调。在DIC图像（图2（c））中，特征显得浑浊，正常的灰度色调以各种深浅不一的棕色和红色呈现。同样，再结晶尿素的偏振光图像（图2（d））看起来太绿，而放射虫的霍夫曼调制对比图像（图2（e））具有明显的绿色背景（和高光）。荧光图像（图2（f））通常不会出现色彩平衡问题，主要是因为它们以小范围的波长为主。
色彩平衡或色彩再现的变化现象在日常活动中被大多数人所熟知，并且通常被认为是不需要任何干预的自然现象。例如，日落时分日光的金色品质非常熟悉，与荧光办公室照明相比，烛光中的颜色看起来截然不同。人类视觉系统通过将眼睛的感觉反应与大脑对信号的解释相结合来适应光的颜色和强度的变化。因此，白色物体在变化很大的照明条件下被解释为白色。通常，如果正确感知白色，其他颜色和色调也会到位。相比之下，图像传感器，无论是传统胶片还是现代数码相机，都会对曝光时固定的照明产生响应。生成的图像的色彩质量将取决于设计到薄膜中的色敏层的特定响应，或固态传感器的各个颜色感应元件（像素）的灵敏度。无论使用哪种捕获方法，都可以通过在照明或成像光路中引入滤色片来修改图像的色彩平衡，但数字方法具有明显的附加优势，即允许对传感器响应进行电子精确调整。
数码相机白平衡基础知识
用于记录图像的传感器，无论是传统的照相胶片还是数字成像设备，通常设计或调整，使其基线响应与广泛的一般照明类别相匹配。例如，照相胶片最常分为两大类，适用于日光或钨丝灯照明源，并且通过使用适当的滤光片对关键应用的胶片响应进行微调。固态传感器通常是电荷耦合器件（CCD）或互补金属氧化物半导体（CMOS）光电二极管检测器，能够以电子方式进行调整，以匹配其对各种照明源的响应特性。
CCD或CMOS探测器的各个光传感元件本质上是单色的，通过依次将入射光通过红色、绿色和蓝色滤光片传递到整个传感器上（为每种颜色产生单独的图像，随后进行组合），或通过微型聚合物薄膜滤光片来实现其颜色灵敏度，这些滤光片以马赛克图案放置在阵列的每个像素上。最常见的滤波器排列是红色、绿色和蓝色滤光片的有序镶嵌阵列，它在整个传感器阵列上重复G-R-G-B模式。这种排列称为拜耳滤波器模式（见图3（a）），包含的绿色元素是红色或蓝色的两倍。额外的绿色传感器像素使成像设备能够更接近人类视觉系统的颜色响应，其在绿色光谱区域（约550纳米波长;图3（b）），因此有助于输出具有视觉上可接受的色彩平衡的图像。通过白平衡控制功能实现传感器阵列相应像素（或单色图像）中单独的红色、绿色和蓝色信号幅度的调整，以实现采集图像的色彩平衡。一些相机系统通过软件而不是硬件控制或补充硬件控制来执行这些调整。
图 3 - 拜耳滤波器阵列模式和光谱图
用于通用应用的数码相机是许多显微镜学家所熟悉的，并且越来越多地被调整为安装在显微镜上，作为专用研究级成像系统的经济替代品，尽管它们的功能通常更有限。由于将数码相机用于常规目的所涉及的技术可以扩展到理解显微镜应用中的白平衡调整等因素，因此首先考虑非技术情况是有用的。控制白平衡调整的基本概念对于一般摄影应用和显微镜成像是相同的。
传统的数码相机通常为用户提供许多不同的白平衡设置，这些设置可以选择为“预设”。这些可能对应于广泛的照明类别，例如日光（晴天或阴天条件）、钨丝灯、荧光灯或各种其他照明场景。许多相机允许对预设值进行微调，以实现更精确的图像色彩平衡。某些相机具有附加功能，可以参考白卡、墙壁或其他对象来调整白平衡，如果包含在图像中，则应表示为白色。在实践中，摄像机的位置使白色物体充满视野，并且通过切换设置或操作菜单中的选择（取决于特定摄像机）来启动白平衡调整，然后摄像机进行适当的传感器调整以将目标渲染为白色。
参考定义的白色物体进行调整是在采集图像期间采用的相同照明条件下进行的，并且可以提供高度准确的色彩平衡校准。但是，如果照明发生变化，则必须重复该过程。高级摄影师通常选择通过使用与照明匹配的白平衡设置以外的白平衡设置来修改图像，以实现所需的美学效果。例如，可以使图像的色调看起来比使用“正确”白平衡时更冷或更暖。当然，如果意图使用准确的场景再现，则此类效果被视为错误，类似于在钨丝灯照明中使用日光平衡胶片，反之亦然。
在关键应用中通常应避免使用一种流行的色彩平衡技术，在消费类相机中通常称为自动白平衡调整。该方法旨在应用于图像场，因为图像被采集，并通过评估整体视野，平均相对于色调存在的光值，并尝试平均或归零任何整体颜色偏差来发挥作用。自动平衡技术的缺点是，任何视场中都存在的颜色值表示色调的“平均”分布，这些分布组合在一起以产生中性灰色或白色。实际上，如果求和像素响应与编程（预期）总体平均值不相似，则相机所做的白平衡调整将不会产生准确的色彩再现。
在显微镜下观察的典型标本在颜色分布上差异很大，并且通常表现出单一的主要颜色（特别是在荧光中）。对主要具有红色组织染色的标本执行的自动白平衡调整可能会产生与应用于蓝色染色制剂的相同程序截然不同的色彩平衡。两者都不太可能产生准确的标本表示。相机电路尝试平衡探测器响应以输出平均整体颜色值，将在不同的标本上产生截然不同的结果，特别是如果给定视场具有强烈或主色。当然，有一些标本在自动白平衡下产生可接受的结果（很可能是那些具有大量白色或灰色区域的标本），但该技术缺乏使其常规有用的可重复性。
显微镜中的白平衡调整
在考虑讨论的优化白平衡的不同方法时，很明显，某些技术不适合光学显微镜的限制和要求。使用特定照明类型的预设值假定光源的特性是固定的，并且具有色温和其他光谱质量的标准值。当使用卤钨灯时，显微镜中常见的做法是改变灯电压以控制光强度或最大限度地减少热量产生。这样做会产生照明色温的变化，如果在数码相机上使用钨丝灯照明的标准预设值，则会导致色彩平衡不正确。颜色再现变化的另一个来源是随着灯在其使用寿命期间的老化而颜色输出发生的变化。
对于在日光（约5500K）色温区域进行最佳平衡的光源也存在类似的问题。不仅“日光”的色温是可变的，而且很少有人能准确地模仿日光光谱质量。从理论上讲，通过允许自动电路校正微小的照明波动，这些困难至少可以部分克服，但其他问题通常使这种方法不可取。通过自动评估图像场，局部标本变化可能会在色彩平衡中产生重大误差。一般来说，大多数显微镜应用的最佳方法是将白平衡评估限制在精心选择的图像区域或其他合适的目标。
图4 - 白平衡调整的点和选框选择器区域
当使用数字捕获设备在光学显微镜中对彩色标本进行成像时，获得正确的色彩平衡以提供标本的真实表示通常是主要目标。故意偏离此策略通常只是为了纠正试样制备中产生不良色偏的问题。大多数科学级数码相机，包括专为显微镜设计的数码相机，都依赖于参考所选颜色值来调整白平衡。在透射照明中，从标本场中选择适当的区域（通常为白色或中性灰色），或者仅在照明场上进行调整，将标本从光路中移除。为了在利用反射照明的显微镜中进行白平衡调整，可以在显微镜载物台上放置白色或中性灰色卡片（或纸片）代替标本。随后通过测量从白卡表面反射的光来获取白平衡设置。
大多数设计用于显微镜的数码相机都是通过驻留在主机上的软件控制的，并且通常配置为与许多显微镜功能交互。例如，尼康DXM 1200数码相机系统的软件界面代表了目前可用的商业产品，以实现白平衡调整的方式。在用户界面中激活白平衡调整窗口后，可以选择视场中的区域，以便相机系统进行白平衡评估。应仔细评估显示器上的实时图像是否有适当的白色或中性灰色区域，以作为图像传感器的参考点。如果显示器上显示的图像具有与显微镜目镜中观察到的色彩平衡不同的色偏，则必须调整相机系统的白平衡，以便呈现准确的标本图像。理想情况下，当选择适当的标本区域进行白平衡调整时，相机的色彩平衡电路将消除显示的色偏。
图4显示了可用于设置数码相机白平衡算法的几个典型样本区域示例。标本是用微分干涉对比成像的成纤维细胞活培养物（图4（a）），在明场照明下马铃薯组织中淀粉颗粒的四重染色薄片（图4（b））和相差中的人红细胞（图4（c））。每个图像上适合使用区域选择技术进行白平衡调整的区域以红色勾勒，而黄色箭头表示图像上的特定点，这些点在选择单个像素时可能会产生令人满意的白平衡校准。
交互式教程 - 数字成像中的色彩平衡
数码相机上的白平衡和黑平衡设置可用于调整色彩平衡。
选择作为白平衡参考的区域应尽可能大，并且没有渗入封片介质的试样污渍的着色效应。许多系统中的白平衡调整软件可以选择图像中的单个点（像素），也可以选择可能通过鼠标光标选框选择来指定的更大区域。通常通过选择尽可能大的区域来获得更好的结果。如果选择单个点进行调整，则结果可能会发生更大的变化，因为红色、绿色和蓝色像素强度的局部波动组合会影响白色的整体视觉效果。通过选择更大的区域，可以获得传感器阵列中更多像素的平均值，从而提高实现可接受的色彩平衡的可能性。选择参考区域后，开始白平衡调整，相机系统利用算法或查找表（LUT）设置适当的电子值（例如每种分量颜色的传感器增益），以产生中性色或白色值。如前所述，无论传感器是安装在相机、望远镜、激光工作台还是显微镜中，数字图像的色彩平衡都受到CCD或CMOS图像传感器收集的波长光谱的严重影响。在采用这些固态器件的彩色数码相机中，通常需要进行一系列平衡调整，以产生符合照明源色温的可接受的彩色图像。
应考虑成功实现适当色彩平衡的几个准则：
1.CCD图像传感器对红外光敏感，只有过滤掉较长波长的红外线，才能实现可见光成像的最可靠性能。某些系统可能会在相机内加入红外阻挡元件，但如果确定情况并非如此，则应添加适当的过滤以在到达图像传感器之前排除这些波长。
2.对于在标本图像、空白标本载玻片或反射光参考（如白色表面）上进行白平衡调整的任何显微镜配置，显微镜应将光学系统对准以获得适当的科勒照明，并精确聚焦在标本平面上。确保这些条件可以最大限度地减少由色差引起的视场照明不均匀或颜色异常的问题。
3.通常，图像传感器的性能在较高色温区域是最佳的，这要求卤钨照明器在数字成像的建议电压调整范围的上限下工作。任何必要的照明强度降低都应始终使用中性密度滤光片，而不是通过降低照明灯的电压来实现。同样，如果将通常用于日光平衡彩色胶片摄影的色彩平衡滤光片插入照明路径，则数码相机最容易实现适当的色彩平衡。尼康将此滤镜称为NCB（中性色彩平衡），尽管其他制造商对具有相同用途的滤镜有不同的名称。
4.与选择极亮区域作为白色参考相比，调整标本视场中性灰色区域的白平衡可能会产生更准确的结果。由于一种或多种分量 （RGB） 颜色过度饱和，完全“褪色”或超出传感器动态范围的区域可能会在图像中显示为白色。色彩平衡电路在此类区域执行的增益补偿可能会产生不准确或不可重现的结果。灰色区域（具有中性密度）由红色、绿色和蓝色像素传感器（或单独的RGB彩色图像）的大致相等的信号电平产生。因此，基于中性区域的准确色彩平衡更容易实现。
5.有几个变量会影响在显微镜下采集的图像的色彩平衡，了解它们的相互关系对于获得可接受的结果非常重要。通过成像软件界面进行的曝光设置是通过图像传感器电路的增益调整来实现的。由于白平衡调整也是通过RGB传感器的选择性增益补偿来实现的，因此在开始白平衡调整之前，应将曝光水平设置为大致正确的值。如果在设置白平衡校正后更改曝光时间，或者需要对增益和偏移进行其他更改，建议重复白平衡设置步骤，因为所有这些因素都会相互作用。同样，对影响光特性的显微镜组件所做的更改（例如光圈调整、滤光片更改和切换物镜）可能会改变白平衡，需要再次执行校正才能获得最准确的图像。
6.如果特定应用需要在选定组中（根据标准程序制备标本）中的一个标本与另一个标本之间进行关键的颜色判断或比较，则重要的是不要对每个标本重复白平衡调整。在这种情况下，最好的程序是仅对照明进行初始白平衡校准（使用空白显微镜载玻片），然后获取单个标本的图像，进行任何必要的曝光调整。再次用空白载玻片代替标本后，应在照明区域重复白平衡程序，而不对曝光或显微镜配置进行任何更改。然后，应以相同的白平衡、曝光等设置对被比较的标本进行成像。如果需要更改曝光，则应将其保持在最低限度，以避免影响色彩平衡。重申此类应用中的关键概念（其中比较试样之间的色彩再现以进行测试或诊断），白平衡调整应仅在光源上进行，而不是针对每个标本进行校正。因此，可以比较每个标本在显微镜照明源上赋予的颜色效果。
7.光学显微镜中采用的某些照明和对比度增强技术在调整数字捕获系统的白平衡方面带来了额外的挑战。偏振光、暗场和荧光方法通常呈现视场，其中标本在深色背景上以深饱和的颜色渲染，几乎没有白色区域。一些相机系统提供了一种机制，用于为这种类型的成像情况设置暗平衡或黑平衡，其中没有合适的白色或中性灰色区域可用。此方法为传感器响应建立基线设置，并可提供令人满意的色彩平衡。
8.深色背景标本图像的另一种技术是在移除标本的情况下对照明区域进行白平衡调整。然而，对于高度饱和、颜色深的标本，适当的成像曝光可能需要极其明亮的照明或相对较高的相机增益设置。如果在没有标本的情况下在明亮的照明区域上进行白平衡调整，这可能会限制白平衡调整的准确性。为了使白平衡电路能够在与标本相似的亮度水平（并且在大致正确的曝光设置下）评估照明，可以在白平衡调整期间将中性密度滤光片插入光路，然后替换为标本进行实际成像。为了选择接近试样透射曲线的中性密度滤光片，需要进行一些实验。
白平衡操作
经常会遇到在图像捕获过程中无法按照常规协议实现可接受的白平衡的情况。在这些情况下，有时可以采用非标准技术，有效地“欺骗”相机的白平衡功能以产生特定的色彩平衡，这可能被认为是正确的，也可能不是，但达到了预期的效果。如果即使这种策略也无法提供可接受的色彩再现，或者如果现有图像最初是在色彩平衡不佳的情况下采集的，那么使用尼康的NIS-Elements等软件进行采集后图像处理可以提供一定程度的校正。
“强制”白平衡功能偏离其正常行为的基本技术是对白色以外的颜色执行白平衡。如果非白色色调呈现给相机为白色，传感器增益电路将尝试将输出推向相反（或互补）的颜色，以补偿非白色色调。实际上，红色、绿色和蓝色通道的相对大小被改变以将颜色再现为白色，同时将图像中的其他颜色推向相同的互补色调。例如，具有红色色偏的图像，如果相机电路无法接受校正，通常可以通过校准红色参考目标来平衡。为了将红色目标再现为白色，传感器的蓝色和绿色像素输出都增加了，增加了补偿红色所需的互补青色色调。按照类似的逻辑，黄色目标上的色彩平衡会导致在整个图像中添加蓝色。这种技术在色彩平衡中的应用需要仔细分析，以确定可以有效地添加或减少哪种色调来纠正图像问题。
图5 - 在数字图像中强制进行白平衡校准
图5所示的是由于掩模或制备错误而出现色偏的几张标本的数字图像。图5（a）所示的集成电路（以反射光微分干涉对比成像）在表面上包含一个氮化硅钝化层，其作用类似于黄色滤光片。从芯片表面反射的波前必须穿过涂层才能到达物镜，并且许多较短的波长（蓝色和绿色）被阻挡。通过在图5（a）中的黄色箭头指示的点上校准数码相机白平衡，可以在很大程度上消除钝化层产生的黄色色偏，从而产生具有出色色彩平衡的图像（图5（b））。同样，图5（c）中描绘的（美国椴木树）过度染色的薄片也可以用相同的方式进行校正。在没有组织的区域选择用于白平衡校准的像素（参见黄色箭头;图5（c））产生的图像具有干净的白色背景和良好的饱和度颜色（图5（d））。荧光样品制剂通常可以将未结合的荧光团渗入周围的封片剂中，以产生类似的“过染色”效果，如图5（e）所示，用于蕨类植物薄切片。使用复染特征上的像素（图5（e）中的黄色箭头）设置白平衡数码相机校准通常会减少最终图像中的背景荧光量（图5（f））。
为了应用上述技术，各种滤色片通常可用于透射光配置。专为彩色照相印刷而设计的滤光片组适用于此目的。这些套装包含每种原色的一系列密度，可以组合以产生所需的任何色调。对于反射光显微镜，非白平衡需要合适的反射颜色参考。目标不一定符合任何颜色标准，通常需要实验才能产生所需的结果。可以使用任何彩色反射表面，但希望具有广泛的色调和饱和度变化范围。家庭中心或油漆商店提供的油漆颜色样本卡是理想的用途，因为它们几乎提供所有可以想象的颜色变化。在某些情况下，可以使用标本本身的选定区域来设置非色白平衡校准。
无论是在透射光中使用滤光片还是在反射光中使用反射目标（例如油漆样品卡），操纵相机白平衡功能的概念都是相同的：非白色的白平衡校准将导致相机的电路删除目标颜色并将其渲染为更中性的灰色调。在大多数情况下，只需要细微的变化，实验将确定目标的色调和饱和度，从而在整体图像平衡中产生必要的变化。在淡蓝色上保持平衡会导致整体变暖效应，或向红色转变。相反，使用淡红色作为参考将产生蓝色向较冷的色彩平衡偏移。其他颜色校正遵循相同的一般逻辑。对任何给定颜色执行白平衡都会导致相机的电路将色彩平衡转向互补色。需要强调的是，这些非传统的色彩平衡技术是一种潜在的机制，可以在常规方法失败时（由于与特定样品制备、光源或成像设备有关的原因）实现预期结果。在这些情况下，仍然可以通过抵消相机对标本调色板的响应来获得可接受的图像。
虽然最初采集具有适当色彩平衡的图像总是可取的，但在通过图像编辑软件应用后处理操作进行采集后，可以进行一定程度的校正。这些程序不能替代适当的相机内白平衡，必须谨慎使用，以避免样本再现中出现不可接受的变化。色彩平衡的一般更改会影响图像的所有区域，但这有时是可以接受的折衷方案，因为微小的变化会产生相对较大的背景色调变化，而对颜色更强烈的标本特征的影响较小。
在图像编辑程序中对色彩平衡进行的调整可以采取不同的形式，具体取决于所需的控制级别。可以通过更改每个通道的输入和输出值之间的关系直接对红色、绿色和蓝色通道进行操作，或者可以对组合的 RGB 信号进行修改。采集后色彩平衡程序的细节可能因方法和所使用的特定软件而异。下面介绍了流行的软件包Adobe Photoshop的几种图像调整技术，尽管可以使用任何提供类似功能的图像处理程序。
图6 - 使用Photoshop级别设置进行色彩平衡调整
许多图像编辑程序提供出色的功能和多功能性，并且可以对色调平衡、饱和度和其他特性进行高度控制。在许多情况下，快速简单地更改色彩平衡就足以纠正小问题，并且在 Photoshop 中，可以通过“图像调整”菜单的“色阶”或“曲线”窗口访问。在任一窗口中，都会出现三个吸管图标，可以通过单击鼠标单独选择。选择吸管工具后，鼠标光标可用于通过单击图像区域来采样图像像素的颜色值。左右滴管用于建立白色和黑色图像值，而中心吸管工具控制图像的中间调（灰度）值。中间色调灰阶选择器为快速校正色彩平衡问题提供了最直接的方法。
使用Photoshop中的色阶功能进行的色彩平衡调整如图6所示，用于显微镜中捕获的几张数字图像。图6（a）中的成纤维细胞使用卤钨照明记录，光路中没有日光滤光片，因此整体呈淡黄色色偏。在没有细胞结构的区域上使用中间调吸管设置（图6（a）中的黄色箭头），可以有效地从处理后的图像中去除色偏（图6（b））。或者，白电平吸管设置可以消除卤钨照明在染色薄片中产生的黄色色偏（图6（c）和6（d）），而黑色水平设置用于降低荧光图像上的过度染色水平（图6（e）和6（f））。在后一个示例中，吸管工具可用于在具有不同程度的红色背景级别的像素之间进行选择，以最大程度地减少不需要的荧光。
与色阶功能类似，Photoshop 软件中的曲线调整选项提供了一种简单直接的方法，可以通过在图像区域中选择来指定白色、黑色和灰度值，并启用图像伽玛的交互式调整。如上所述，也可以通过“色阶”选项以类似的方式执行色彩平衡调整。打开要修改的图像文件后，从菜单栏中选择图像/调整/曲线，这将打开曲线调整窗口。通过单击鼠标光标选择中间的吸管按钮，然后评估图像以标识应呈现为中性灰色调的区域。单击此区域应使图像进入大致正确的色彩平衡。
使用色阶或曲线Photoshop 工具时，请确保选中“预览”复选框，以便更改立即反映在图像中以供评估。通过反复单击图像中的不同区域，通常可以找到适当的灰度值，以产生可接受的色彩平衡。在某些情况下，图像中不存在适当的灰色或中间色调值，在这种情况下，黑色或白色级别的吸管选择器可能会产生更好的结果。这些采用的方式与中间调平衡操作类似。在选择图像中的黑色或黑暗区域之前，应单击左侧滴管按钮（在软件中显示为一半填充黑色墨水），而单击右侧滴管可以在图像中的白色区域上保持平衡。通过实验，通常可以对各种色彩平衡不正确的数字图像进行可接受的失衡色彩校正。
在调整色彩平衡之后，可以通过操纵伽马曲线特性来修改图像亮度和对比度。“曲线”窗口中的图形区域允许通过在拖动时单击并按住鼠标光标将曲线修改为任何形状。图像亮度和对比度的整体变化最容易通过对组合的RGB曲线进行操作来产生，这将对色彩平衡（先前调整）产生最小的影响。但是，可以通过从下拉菜单中选择每个通道并通过拖动鼠标光标来重塑该通道的曲线，从而更改各个红色、绿色和蓝色通道的 gamma。当然，这些对各个颜色通道的调整会对相对颜色值产生影响，并提供另一种微调和评估色彩平衡变化的技术。
在“曲线调整”窗口（或其他图像调整功能）关闭之前，可以保存已应用的校正，以便与其他图像（例如，可能在类似条件下获取的图像）一起使用。这种技术对于应用于一系列具有类似色彩平衡缺陷的图像很有价值，即使它们没有合适的中性或白色区域。如果序列的一个图像具有适合平衡的灰度值，或者最初可以通过曲线操作进行校正，则相同的校正通常适用于类似的图像。要应用保存的校正，请打开目标图像，然后从“曲线”（或“色阶）调整”窗口中加载保存的文件。应用校正因子后，可以评估图像以确定是否需要额外的曲线调整。
图7 - 使用Photoshop曲线设置进行色彩平衡调整
图 7 显示了使用 Photoshop曲线功能校正的一系列数字图像。图7（a）中的染色人体组织具有黄色色偏，通常出现在伊红和苏木精染色标本中。使用白电平吸管工具选择背景区域（图7（a）中的黄色箭头）以类似于镨滤镜和传统胶片的方式渲染具有适当色彩平衡的图像（图7（b））。通过选择使用中间调吸管调整曲线的背景区域，可以去除在光路中用日光滤光片记录的相衬图像（图7（c））中存在的蓝色色偏（图7（d））。最后，使用中间调吸管工具可以轻松去除放射线骨架的霍夫曼调制对比图像（图 7（e））中的绿色背景（图 7（f））。
一种称为近似颜色一致性的现象使个人能够在精神上纠正照明的变化，使物体在“已知”为白色的情况下看起来是白色的。这种色彩再现的适应程度取决于视野中是否有参考光源。在日常情况下，当观众沉浸在主导光源中或被主导光源包围时，很容易做出调整。例如，在户外阳光下观看的一张白纸被视为白色，如果带入室内并在昏暗的钨丝灯下观看，它仍然显示为白色。尽管在白炽灯下观察时，纸张反射了更多的长波长黄光和红光，但这种下意识的调整还是发生了。在观看彩色照片或电视时通常不会进行色彩平衡调节，因为周围环境中存在作为参考的其他光源。一般来说，物理现实和感知之间存在许多可能的差异，了解这些因素对于显微镜中捕获的图像的正确色彩平衡非常重要。
因此，在评估和调整色彩平衡时，最后一个考虑因素是观看环境对色彩感知的影响。如果在计算机显示器上查看图像，则应在计算机软件中以及显示器的亮度、对比度等硬件调整中仔细校准显示器的显示参数。如果使用多个显示器，则这些变量尤其重要，例如，如果一个显示器专用于显微镜上的数码相机，而另一个显示器与打印机或其他输出设备一起使用，则可能出现这种情况。当通过涉及不同显示方法或不同照明条件的比较进行颜色判断时，必须考虑这些因素。例如，在显示器上查看捕获的图像可能会导致不同的色彩平衡印象，具体取决于显示器是在黑暗的房间中使用，还是在日光或明亮的荧光灯下使用。同样，正在目视评估整体色偏的显微镜载玻片，例如由于污渍渗入封片介质而导致的色偏，在举向窗户时与用钨丝灯观察时看起来完全不同。在光学显微镜中获取色彩平衡的图像最终涉及相互作用的组件，这些组件决定了在捕获过程中如何记录标本颜色以及捕获前后如何感知标本颜色。
总之，显微镜照明源和胶片乳剂或图像传感器校准之间缺乏适当的色温平衡是显微摄影和数字成像中意外色偏的最常见原因。如果光源的色温对于胶片或传感器特性来说太低，则产生的显微照片和数字图像将具有整体黄色或红色色偏，并且会显得温暖。另一方面，当光源的色温过高时，生成的图像将出现蓝色色偏，并且会显得很酷。不匹配的程度将决定这些颜色变化的程度，较大的差异会导致颜色变化的极端。固态数码相机系统也会产生相同的效果。尽管这些色偏看起来很有问题，但通过正确使用转换和光平衡滤镜，或者通过正确校准数码相机的白平衡电路，它们总是很容易纠正。
