前言
对于任何电子测量系统，信噪比（SNR）表征测量质量并决定系统的最终性能。许多用于显微镜的数码相机使用CCD（电荷耦合器件）图像传感器，SNR值具体表示测量的光信号与组合噪声的比率，组合噪声由电子系统中产生的不良信号成分和入射光子通量的固有自然变化组成。由于CCD传感器在一系列离散的物理位置上收集电荷，因此信噪比可以被认为是相对信号幅度，与测量不确定度相比，基于每个像素。CCD成像系统中的三个主要噪声源是光子噪声、暗噪声和读取噪声，在SNR计算中必须考虑所有这些因素。
教程说明
本教程初始化时，显示信噪比图形图，作为假设CCD系统的积分（曝光）时间的函数，其规格是显微镜成像应用中使用的高性能相机的典型规格。对于本教程中建模的系统，可以通过使用鼠标重新定位位于显示窗口下方的任何滑块来改变影响CCD传感器信噪比的参数。更改每个变量时，信噪比的计算值将在左侧黄色框中更新。在使用包括CCD在内的电子传感器进行图像采集过程中，信号强度的明显随机波动构成了叠加在信号上的噪声，并且随着噪声幅度的增加，被测信号的不确定性变大。对直接影响信号电平的因素以及主要向系统提供噪声的变量所做的更改，会对SNR产生反比影响，反映在显示值中。大信噪比在采集高质量数字图像时非常重要，在需要精确光测量的应用中尤其重要。标有合并因子的单选按钮可以单独选择，以实现科学CCD相机常用的信噪比改进方法，其中来自相邻像素组的信号产生的电荷在读出期间组合成更大的“超级像素”。像素合并因子表示组合在一起以形成每个较大像素的像素数。当重新计算SNR以反映合并操作时，假设组中每个像素的信号相同。
来自CCD成像系统的测量信号用于计算SNR，取决于入射到CCD上的光子通量（表示为每秒每像素的光子），设备的量子效率（其中1表示100%的效率）以及收集信号的积分（曝光）时间（秒）。这三个变量的乘积决定了信噪比的信号部分（分子），该信号部分与影响该比分母项的所有噪声源进行权衡。本教程中的“量子效率”滑块提供 20% 到 98% 的调整范围，“光子通量”滑块允许选择每秒每像素 0.1 到 10000 个光子之间的入射光级别。积分时间滑块可在 0.1 到 100 秒的范围内调整 CCD 积分时间。
提供滑块用于改变读取噪声（每像素 2 至 20 个电子有效值）和暗电流（每秒每像素 0.01 至 50 个电子）的 CCD 规格。光子噪声对总噪声的贡献是信号电平的函数，不是可以通过相机设计或操作方法降低的独立噪声变量，而是在SNR计算中考虑的。右侧黄色数值场（检测到的光子/像素）显示CCD在滑块当前设置的积分周期内为每个像素读出的信号光子总数。该值表示光子通量、量子效率和积分时间的乘积。操作五个滑块，加上相邻的单选按钮，产生一系列信噪比值，对应于使用专为显微镜低光成像而设计的CCD相机时可能遇到的大多数操作条件。当教程最初加载或重置时，滑块位置默认为使用制冷CCD的高性能科学级相机系统的典型值。
在计算总SNR时，考虑了三个主要的不良信号成分（噪声），它们通过降低信噪比来降低CCD成像设备的性能：
光子噪声（有时称为散粒噪声）是由入射到CCD上的光子到达率的固有统计变化引起的。半导体器件内产生的光电子构成信号，其大小受到波动的干扰，这些波动遵循给定位置入射到CCD上的光子的泊松统计分布。因此，光子噪声或测量变化等效于信号的平方根。
暗噪声是由CCD硅结构内热产生的电子数量的统计变化引起的，这与光子诱导信号无关，但高度依赖于器件温度。在给定CCD温度下热电子的产生速率称为暗电流。与光子噪声类似，暗噪声遵循暗电流的泊松关系，相当于图像曝光时间内产生的热电子数的平方根。冷却CCD可显著降低暗电流，在实践中，高性能相机通常被冷却到在典型曝光间隔内暗电流可以忽略不计的温度。
读取噪声是将CCD电荷载流子转换为电压信号以进行量化的过程以及随后的处理和模数转换过程中固有的系统噪声成分的组合。对读取噪声的主要贡献通常来自片内前置放大器，并且该噪声均匀地添加到每个图像像素中。高性能相机系统利用设计增强功能，大大降低了读取噪声的重要性。
本教程中的CCD信噪比计算使用以下公式：
信噪比 = PQet / [ PQet + Dt + Nr2]1/2
应该考虑的另一个因素是入射和背景光子通量以及量子效率的值是波长的函数，当使用宽带照明源时，信噪比的计算需要将这些变量积分到用于成像的所有波长上。
在高性能CCD成像系统中，使用各种方法来提高信噪比。为了减少CCD半导体层内产生的热电荷（表现为暗电流），有时会采用特殊的器件制造技术和操作模式。通常使用热电或低温制冷来冷却CCD以将暗电流降低到可以忽略不计的水平，或者如有必要，可以采取液氮冷却的极端方法。通常，高性能CCD传感器在室温以下冷却时，每冷却5至9摄氏度，暗电流就会减少一半，这一规格称为“加倍温度”。这种改善速度通常持续到零下约5至10度的温度，超过该温度，暗电流的减少会迅速减少。除了专门的电路和电子设计外，有时还采用利用高级积分器和双采样方法的滤波技术来消除读取噪声的某些成分。
图 1 - 随积分时间变化的信噪比
图 2 - 随积分时间变化的信噪比
由于光子噪声是CCD信号检测的固有属性，无法通过相机设计因素来降低，因此它本质上代表了一种“本底噪声”，即可实现的最小噪声水平，随着光子通量的增加，相对效应逐渐减小。因此，希望在受光子噪声限制的条件下操作成像系统，其他噪声分量减少到相对无关紧要。在低照度条件下（假设CCD冷却基本上消除了暗噪声），读取噪声大于光子噪声，并且图像信号被称为读取噪声限制。可以增加相机曝光时间（积分时间）以收集更多的光子并提高SNR，直到达到光子噪声超过读取噪声和暗噪声的点。超过这个曝光时间，图像被称为光子噪声限制。
可用于图像形成的光子数量有限是许多显微镜技术的关键因素，高性能CCD相机系统专门设计用于在比传统相机低得多的信号电平下达到光子噪声限制操作模式，传统相机通常无法在低光照水平下实现光子噪声限制性能（和适当的高SNR）。在通常使用CCD相机的宽视场显微镜中，标本焦体积提供的总信号可能会变化几个数量级，这在很大程度上取决于所使用的成像技术和标本本身。来自焦体积的光子通量为每秒10e6（100万）光子，这是一个极低的光照水平，相当于平均1个光子/像素/秒分布在具有100万个有效像素的传感器表面上。作为参考，暗适应眼睛的最小检测限约为其40倍（4000万光子/秒）。设计合理的荧光显微镜通常从焦体积每秒产生10e8至10e9光子，或使用相同的100万像素传感器每秒产生100至1000个光子/像素/秒。传统的明场成像模式通常产生5000至约40，000光子/像素/秒的整个传感器区域的平均照明水平。除非积分间隔非常短，否则宽场图像的明亮区域可以产生每像素超过100，000个光子的总检测信号。
图1显示了典型高性能CCD相机的信噪比与积分（曝光）时间的关系图，该相机专为低信号电平成像而设计，光子通量和传感器特性固定在图中所示的值。在这种类型的图中，可以识别读取噪声限制区域和光子噪声限制区域，在光子噪声开始超过读取噪声的曝光时间分开（图中指定的传感器和光通量值约为0.15秒）。由于光子噪声与信号的平方根关系，两个区域之间的这种划分发生在曝光时间，其中每个像素检测到的总信号大约是读取噪声值的平方。例如，读取噪声规格为每像素5个电子均方根，当曝光时间足以在现有入射光子通量下每像素检测到25个以上的光子时，光子噪声成为主要噪声源。交互式教程显示的图类似于图 1 中的图，但反映了图形图在调整滑块控制的每个变量时的变化。除了左侧显示的计算SNR值外，右侧的黄色窗口更新了检测到的光子/像素的值，并且图表上半部分的红色文本消息会发生变化，以指示读取噪声还是光子噪声在滑块选择的值中占主导地位。绘制曲线后面有一个红色箭头，表示当前选定的积分时间。两种主导噪声制度之间的转换假设暗噪声可以忽略不计，这在科学级CCD成像系统的操作中是典型的，尽管其他情况也是可能的。在某些情况下，在高暗电流水平下工作会改变读取噪声和光子噪声相对值的重要性，在这种情况下，暗噪声会压倒信号和其他噪声分量。
图 3 - 通过合并实现信噪比改进
一些科学级CCD相机允许实现片上像素合并功能，作为提高信噪比的另一种机制。应该认识到，这种方法涉及牺牲一些空间分辨率，以及伴随暗电流的增加。通过提高CCD的信噪比，成像系统能够在较低的光照水平和/或更短的曝光时间内达到光子噪声限制条件。一些相机系统自动利用像素合并模式对预览图像进行监视器显示，以快速帧速率提供更明亮的图像，从而有助于标本定位和聚焦。为了演示对计算出的 SNR 的这种分档效果，本教程提供了对应于三个分档因子的单选按钮。按钮标签指示像素数，如下所示：1 像素，无像素合并;4像素，2x2像素阵列合二为一;16像素，4x4像素阵列合二为一。图2显示了不同分档值对曲线的影响，曲线绘制了SNR随曝光时间的变化。修改了教程中用于计算 SNR 的公式以考虑分箱，如下所示：
SNR = MPQet / [ MPQet + MDt + Nr2]1/2
在此修改后的方程中，符号M表示分箱像素的数量，并假设每个像素中的信号相同。这三条曲线是针对相同的典型CCD规格绘制的，如图所示，对于非常低的样品信号强度，在传感器上产生每秒入射每像素40个光子的光子通量。请注意，如果没有像素合并，则需要大约4秒的曝光时间才能达到光子噪声限制信号电平。通过实施 16 像素合并，在仅 0.25 秒的曝光时间内达到等效的 SNR 和每像素检测到的光子总数（见图 2），这将允许以足够的帧速率刷新预览图像，即使在低图像强度下也能进行聚焦和标本定位。另一个考虑因素是，与未分档模式相比，使用 4 秒积分时间获取的图像在使用 16 像素合并时信噪比将提高约 5 倍。在许多情况下，特别是在低光照水平下，降低噪点和由此改善图像对比度的好处超过了像素合并过程中固有的理论空间分辨率的损失。
