前言
为了在活细胞成像通常需要的更快时间尺度上获取图像，必须重新设计激光扫描共聚焦显微镜，以结合先进的扫描方案，使光束能够以更高的速度在标本上进行光栅扫描。为了克服传统共聚焦显微镜固有的缓慢速度，一些制造商推出了配备共振扫描镜的仪器，这些仪器能够以每秒30帧或更高的速度收集图像，包括尼康的A1R HD25系统。
教程说明
本教程通过显示叠加在拉伸的朗池光栅（长黑线）上的共振扫描仪像素时钟激光束的余弦模式进行初始化。扫描图案下方是通过光栅传输的光强度和扫描期间产生的像素时钟计数。图表的左侧显示正向扫描，而右侧显示反向扫描。请注意，本教程的速度已大大降低，以演示共振扫描期间发生的各种事件。随着扫描的进行，典型标本显示在“图像扫描”窗口中。还指示水平扫描仪反射镜角度以及像素时钟激光器的反射光束相对于Ronchi光栅的位置。要操作本教程，请单击“扫描图像”按钮以启用对“X扫描”和“Y 扫描”滑块的手动更改。
由于共振扫描仪速度的非线性，荧光标本在中心区域以最高速度扫描，随着扫描到达边缘，速度逐渐降低。因此，当使用以恒定像素速率计时的帧采集卡（假设光束是线性扫描）获取来自共振扫描仪的图像数据流时，图像在边缘处显得拉伸。此外，由于暴露于激光的增加，激光激发强度的不均匀分布（边缘更大）在扫描区域的边缘产生过度的光漂白（和潜在的光毒性）。补偿扫描非线性的最简单选项是将扫描范围限制在振荡周期的那部分，其中振镜的速度几乎是线性的，这发生在大约占总扫描宽度70%的区域。不幸的是，该解决方案减少了可以收集发射信号的时间，增加了再次收集信号之前的扫描周转时间，并且不能防止落在被记录区域之外的标本区域的光漂白。然而，当使用振镜振荡的线性部分时，可以通过结合可调节的孔径来限制样品暴露在照明下的区域，从而最大限度地减少光漂白效应。
幸运的是，非线性谐振计扫描引起的图像失真是可预测的，可以使用软件或硬件解决方案进行校正。无论生成图像涉及何种校正方案，最有效的扫描策略都是在振镜的正向和后向扫描期间收集数据。在正向扫描期间记录数据很简单，但由于反向扫描会反转记录像素的方向，因此必须使用专门的读写缓冲区或软件反转图像数据。实际上，图像以正常宽度的两倍（实际上，对于 512 x 512 像素的最终图像大小为 1024 像素）和正常高度的一半（256 像素）收集。在谐振镜镜的每个正向x轴扫描结束时，提供给线性（y）振镜的垂直锯齿信号递增一条线，反向（x）扫描开始。以这种方式，垂直扫描顺利进行256个周期，直到获得足够的数据用于一张图像。
图1-具有线性像素时钟的共振扫描共聚焦图像
共振扫描共聚焦显微镜的软件和硬件时钟解决方案都依赖于高频谐振振镜的已知位置数据。在 7.9 千赫兹的设备上，该镜子可以绕中心轴在每个方向上旋转约 12 度（总共旋转 24 度）。镜面角位置（θ）和相位或速度（φ）关系可以根据振荡周期的状态进行预测。在振荡周期开始时（镜子位置等于正负12度;见图1），镜子静止，速度等于零。当镜子向中点摆动时，角速度作为相位的余弦函数增加，并在镜角等于零时达到最大值。继续，当镜像接近正向扫描结束时，它会再次减速，直到它达到等于零的速度，因为它会瞬间反转方向。当镜子沿相反方向旋转时，观察到角速度的相同变化。谐振振镜应考虑的另一个因素是，这些器件是高Q值振荡器，当固有电流计频率和外部驱动源之间发生最轻微的漂移时，由于相位和幅度的响应变化很大，因此无法有效地同步到外部频率。因此，谐振振镜本身应用作所有其他定时元件同步的主振荡器。
用于共振扫描共聚焦显微镜的基于软件的时钟方案涉及能够使用基于镜子可预测运动的查找表进行像素数据线性化的算法。例如，一种流行的算法首先确定镜像和图像采集卡的相位常数，然后定位最终图像的中心像素。该算法围绕对称的中心平面运行，其中镜像位置以高精度已知。图像在传送到图像采集卡时，通过一次检查一条水平扫描线来处理图像。像素数据以最终图像宽度的两倍和最终高度的一半存储从扫描仪接收。该过程的第一步涉及从水平扫描线的后半部分反转数据点，然后在图像的前半部分的数据线之间交错倒置数据（图1（b））。由于数据收集与触发采集的水平同步信号启动之间存在滞后，可能无法确定图像的中点，因此软件通常需要将倒置扫描线偏移几个像素。在这种情况下，扫描线的右边缘将作为图像的参考点。序列中的下一步是针对相对于中心像素的每个像素或相位位置应用校正因子。然后将该像素重新定位到最终图像中的正确位置（图1（c））。在理想情况下，使用复杂的高速计算机，可以动态分析传入的数据并实时记录到硬盘驱动器中。
在谐振振镜的水平扫描期间，时钟光电二极管记录由Ronchi光栅散射的激光脉冲，这些脉冲可以电子转换为具有可变频率的像素时钟。当振镜处于其振荡周期的中心部分时，这些光脉冲在时间上会更频繁，但当镜子到达扫描终点并反转方向时，它们会变慢。光电二极管检波器的要求包括能够处理可变脉冲频率（就带宽而言），并且它必须足够大以检测整个线路扫描。检波器连接到跨导放大器，该放大器将光电二极管电流脉冲转换为放大的电压，然后将其馈送到倍频器电路，使每行的像素数加倍。光电二极管和相关电子器件每条线路提供 256 个脉冲，倍频电路将此输出转换为每行 512 个脉冲，由图像采集卡采集并用于构建图像。
图 2 - 基于容池光栅的共振扫描共聚焦像素时钟
图2显示了使用与光电二极管检测器耦合的龙池光栅作为可变像素时钟的基本概念。为了清楚起见，图2（a）所示的光栅仅包含八个等宽间距，叠加一个完整的谐振振镜正弦运动周期随时间的变化（红色曲线;125微秒）。实际光栅有 256 条线间距，并且由于像素时钟激光器实际上在操作中的光栅表面上回走一条线（垂直于不透明线），因此线性尺寸要紧凑得多（图 2（b））。当光束进入和离开Ronchi光栅的透明区域时，光电二极管检测到的透射光强度随着电流计的运动而上升和下降（图2（c））。光电二极管检测到的光强度的每个跃迁（在本例中，从暗到亮）都用于产生触发显微镜捕获图像的像素时钟（图2（d））。尽管图2（d）所示的时钟脉冲在时间上间隔不均匀（范围从大约70纳秒到160纳秒），但它们在图像空间中仍然对应于相等的间隔。
为了以相等的空间间隔（而不是相等的时间增量）采集像素样本，来自主显微镜成像系统的光电倍增管信号通过具有可变增益和偏移的传统放大器，然后由由Ronchi光栅脉冲产生的像素时钟触发的模数转换器进行数字化。然而，由于谐振振镜向两个方向扫描，一半的图像信息被反转。为了在构建图像之前纠正这种双向扫描伪影，数字像素输出首先传输到先进先出（FIFO）或后进先出（LIFO）缓冲区，具体取决于像素是从左到右还是从右到左采集的。因此，在振镜的水平扫描期间，在扫描的前半部分（62.5微秒的时间段）采集的图像像素被馈送到FIFO缓冲器，而在反向扫描期间采集的像素被馈送到LIFO缓冲器。FIFO缓冲器在每次水平线采集开始时被读取并重置为零，而LIFO缓冲器在存储传入数据期间向上计数，在随后的读出期间向下计数，以确保在反向扫描期间采集的像素被反转。
