前言
使用分离滤光片激发平衡器可以轻松完成荧光显微镜激发光谱的微调，以成像双标记或多标记标本，该平衡器包含串联短通和长通干涉滤光片，这些滤光片在整个照明孔径上平移以调整光源波长分布曲线。本交互式教程探讨了尼康Eclipse i系列激发平衡器系统与双激发带和三激发带滤光片组合结合使用时如何影响多重标记样品的荧光发射强度。
教程说明
本教程使用随机选择的双荧光或三重荧光标记标本的图像进行初始化，该样本出现在“标本图像”窗口中。与此窗口相邻的是名为激发通带光谱图的光谱图，其中显示了用于染色样品的荧光团的吸收光谱以及激发平衡器滤光片组合在可见光谱区域中照明孔径处的近似透射百分比（白线）（参见激发平衡器图）。在教程窗口左下角的每个样品中标识荧光探针及其靶标，该彩色条与激发通带图中激发光谱图的颜色一致。可以使用适当的荧光团复选框打开或关闭图表上的各个光谱图。可以使用选择样本下拉菜单将新标本加载到教程中。
要操作本教程，请使用孔径位置滑块在激发平衡器的长波通和短波通区域之间移动显微镜孔径（如教程右下角的激发平衡器图所示）。当滑块向最左侧平移时，孔径移动到平衡器的短通区域，激励通带发生变化，类似于短波通滤波器的轮廓。标本图像也会发生变化，以反映在较长波长区域具有发射光谱的探针的荧光强度损失。将滑块向最右侧移动可将孔径移动到长通区域，并在激发通带图和试样图像中产生相应的变化。在这些极端之间是一个混合区域，其中激励通带类似于两个截止滤波器的混合体（样品图像也是如此）。
尼康Eclipse i系列荧光照明器激发平衡器系统使显微镜学家能够在使用具有双和三激发滤光片组合的光学模块时微调照明孔径处的激发波长通带，以实现最大效率。此功能可用于调整包含多个探针的样品中的单个荧光团强度，例如，减少一个探针的荧光发射，同时增加另一个探针的强度，以优化观察和数字图像的记录。由于多种因素，包括量子产率不均、染色过度或染色不足、膜通透性不足、封闭性差、固定掩蔽抗体结合位点、固有抗原浓度低以及简单的荧光团和二抗混合错误，用两个或多个荧光团染色的标本通常表现出不等的荧光发射强度水平。激发平衡器可以帮助缓解这些样品中的荧光信号不平衡。
图1 - 激发照明平衡器滤波器配置和光谱曲线
尼康激发平衡器由一个矩形光学玻璃窗口组成，其中包含两个薄膜干涉涂层，根据窗口在光学序列中的位置，它们充当长波通或短波通滤光片（或两者的混合物），如教程和图1所示。矩形滤光片安装在与显微镜照明孔径光阑相邻的滑块中，该光阑包含在可拆卸外壳中，该外壳插入显微镜落射荧光照明器（在尼康Eclipse i系列显微镜中称为数字成像头）在光路中的视场光阑之前。通过激发平衡器的光量和激发照明的数值孔径可以通过调整孔径光阑的大小来控制。当观察过度染色的样品时，通常可以使用激发平衡器与中性密度滤光片结合使用，并通过限制孔径光阑尺寸来减少过量的荧光团发射。
图1所示是长通（黄色曲线）和短通（紫色曲线）激发平衡器滤光片的光谱图，以及与滤光片组合特性相匹配的三种荧光团（DAPI、FITC 和 Texas Red）的归一化吸收光谱。在实践中，尼康激发平衡器滤光片组合滑块通过拉动或推动框架手柄在照明孔径上平移，从而将激发光暴露在楔形截止滤光片的不同混合物中。当滑块的位置使照明孔径与激发平衡器的短通部分（紫色曲线下的区域）重合时，只有具有低于520纳米区域的吸收光谱分布的荧光团才会被电弧放电灯的照明激发到很大程度。当滑块移动到激发平衡器窗口的另一端时，长波通薄膜滤光片部分（黄色曲线下的区域）被孔径照亮以激发波长大于430纳米的荧光探针。请注意，无论激发平衡器位置如何，在蓝色光谱区域（450-500纳米）具有激发带的荧光团（例如FITC和Alexa Fluor 488）都以高效率激发。
当显微镜照明孔径位于包含长波通和短波通滤光片部分的“混合”区域时，对于在可见光谱的紫外和黄绿色区域具有吸收带的荧光团，激发效率会有所不同。当照明孔径前面的滑块部分从仅包含短波通干涉滤光片的区域转换为包含相同比例的两个滤光片的区域时，紫外线吸收荧光团的吸收效率从大约100%持续下降到50%。同时，绿色吸收荧光团的吸收效率从零稳定提高到50%，而蓝色吸收荧光团的吸收效率保持不变。当滑块继续运动进入包含较大比例的长波通滤波器的区域时，会发生相反的效果。在这种情况下，紫外线吸收荧光团的吸收效率从50%下降到零，因为绿色吸收荧光团的效率从50%增加到100%。同样，在蓝色区域激发的荧光团的吸收效率保持不变。
图2 - 使用三重激励滤波器的激励平衡器性能
各种常见的荧光团，包括Alexa荧光、花青染料（CyX系列）、BODIPY、荧光蛋白、MitoTrackers、SYTOX核酸染色剂以及许多传统的合成和天然探针，都可以使用激发平衡器与双激发或三激发滤光片组结合使用，轻松分离。例如，图2中显示的一系列图像说明了用Alexa Fluor 405（微管蛋白），SYTOX绿（细胞核）和德克萨斯红（丝状肌动蛋白网络）染色的白化瑞士小鼠胚胎细胞的单层培养物，并用激发平衡器的DAPI-FITC-德克萨斯红三重过滤器组合成像。在图2（a）中，激发平衡滑块位于照明孔径前面的短波通薄膜滤光片区域，以优先激发紫色和蓝色荧光团（Alexa Fluor 405和SYTOX Green）。将滑块转换为激发平衡器的中心区域（包含相等比例的两个滤光片）会产生包含所有三个荧光团贡献的图像（图2（b））。最后，将滑块移动到包含长波通滤光片的区域（图2（c））可消除紫色荧光团，从而产生由荧光团（SYTOX绿和德克萨斯红）产生的图像，这些荧光团在可见光谱的蓝色和黄绿色区域中激发。将DAPI-FITC-Texas Red三重激发带滤光片组合替换为专为DAPI，FITC和TRITC设计的滤光片组合将产生类似的结果，但针对吸收曲线从黄绿色变为绿色（TRITC与德克萨斯红）波长的荧光团进行了优化。
图 3 - 使用双励磁滤波器的励磁平衡器性能
激发平衡器也是使用流行的双带通激发滤光片组合（如DAPI-FITC、FITC-TRITC 和 FITC-Texas Red）分离包含两个荧光探针的样品中荧光发射的理想选择。图 3 中所示的是几个示例。图3（a）显示了用核探针Hoechst 33258（蓝色荧光）和Alexa Fluor 488与鬼笔环肽（绿色荧光）偶联的小鼠小肠薄组织切片，通过双滤光片DAPI-FITC组合与照明孔径前面的激发平衡器的短通部分成像以激发两个荧光团。将激发平衡器转换为长波通区域（图3（b））可消除紫外线吸收核染料（Hoechst 33258）。以这种方式使用，激发平衡器对于控制具有过度染色细胞核的样品中的荧光发射非常有用。
与蓝色和绿色双激发滤光片组合（FITC-TRITC和FITC-Texas Red）耦合，激发平衡器可用于控制标有荧光团的样品的发射强度水平，这些荧光团在绿色到橙色波长区域吸收。图3（c）所示是印度Muntjac鹿皮肤成纤维细胞的贴壁单层培养物的图像，该细胞染色为与鬼笔环肽偶联的Alexa Fluor 555（橙色荧光）染色，Alexa Fluor 488与靶向抗过氧化物酶体膜蛋白（PMP-70）一抗的山羊抗小鼠抗体偶联。使用FITC-TRITC双波段激发滤光片组与激发平衡器相结合，使长波通薄膜滤光片区域与照明孔径重合，捕获图像。将激发平衡器转换为短波通区域（图3（d））可减少（或消除）绿色吸收荧光团的荧光发射（Alexa Fluor 555）。同样，FITC-德克萨斯红滤光片产生类似的效果（图3（e）和3（f））。后两帧中的标本是用Alexa Fluor 594与鬼笔环肽（肌动蛋白）偶联的大鼠胸主动脉细胞培养物和与靶向小鼠抗α-微管蛋白一抗偶联的二抗偶联的Cy2标记的大鼠胸主动脉细胞培养物。
