文章名称：WindSTORM: Robust online image processing for high-throughput nanoscopy
发表期刊：SCIENCE ADVANCES
发表日期：2019年4月
1 背景
超分辨率显微成像技术是生物学家在纳米尺度研究细胞结构功能的重要手段。该技术尽管在空间分辨率上表现优异，但因其需要从成千上万帧图像中精准定位单个分子，成像速度受到了极大的限制。为了提高超分辨率显微镜的成像速度以实现高通量成像，可以采取的策略主要有两个：一是提高单帧图像的分子密度；二是增大成像视角以加快图像采集速度。高通量纳米显微技术可以在几秒钟内产生千兆字节的数据，而且高密度的分子互相重叠，这需要特殊的定位算法才能实现精确定位。传统的高密度定位算法依赖复杂的迭代优化，处理速度极慢，使实现实时图像处理成为一大挑战。此外，更高的分子密度会增加背景荧光的非均匀性，非均匀的背景进一步加重图像的伪影并严重降低定位精度。
2019年4月26日，Science Advances在线发表了匹兹堡大学刘洋实验室的最新研究成果“WindSTORM: Robust online image processing for high-throughput nanoscopy”。为了解决基于迭代优化的传统算法运算复杂以及图像伪影的问题，实现高稳定性的实时高通量超分辨率成像，研究人员开发了WindSTORM方法。
2 方法和结果
WindSTORM算法的主要流程如图1所示：
（1）进行基于时域极值的背景削减法来最小化图像伪影。具体来说，采用线性解卷积以及逆滤波的方法，并使用空间频率截断来分解重叠目标，其中空间截止频率是由光学系统的衍射极限分辨率所决定，图像中高于该截止频率的噪声信息将被去除。
（2）通过寻找局部最大值的方法，识别出重叠的激发态荧光分子。
（3）通过去除每个ROI（region of interest）四周的激发态分子来实现中心目标的精准定位，然后对获得的中心目标进行梯度拟合，进而实现显微图片的超分辨率重建。
WindSTORM可以将非均匀背景造成的图片伪影降到最低，并将分子的定位精度以及空间分辨率增至最优。该算法的所有计算步骤都采用非迭代运算，在保持图像重建高精度的同时，显著提高了图片处理的计算速度。
图 1 WindSTORM算法流程
为了验证WindSTORM的性能，研究人员将其与三个传统的定位算法FALCON，DAOSTORM以及ThunderSDTORM进行比较（图2、图3），采用模拟数据集以及不同样本的实验数据对召回率、均方根误差、假阳性率以及计算速度等指标进行了验证。
实验结果表明，在理想情况下，即背景荧光均匀的条件下，WindSTORM表现出与传统定位算法相似的定位精度，但处理速度比传统算法快2-3个数量级，在GPU上运行时，可以实现实时图像处理。
图 2 不同算法运算时间对比
在实际情况下，即背景荧光非均匀情况下，WindSTORM不仅能够保持较快的处理速度，而且在去除图像伪影及提高定位精度方面展现出巨大优势，在不同的生物样本以及不同的成像条件下都表现出了无可比拟的优势。
图 3 不同算法实验定位效果对比
研究人员指出，该算法是基于FFT（fast fourier transform），要求系统的采样频率超过奈奎斯特采样速率，否则会降低算法的性能表现。而且，WindSTORM中使用的背景估计算法是基于散粒噪声模型开发的，用于处理时变缓慢的背景。由于EMCCD（Electron-Multiplying CCD）相机的电子倍增产生的噪声会影响背景的校准，因此对于高通量纳米显微镜而言，sCMOS相机更受青睐，因其大视场和高帧率。
3 小结
随着下一代超分辨率显微镜朝着高通量的方向发展，研究人员在选择处理算法时会综合考虑成像荧光分子的密度、背景特征、算法的定位精度以及计算效率等因素。实际的生物样本往往是不同密度的荧光分子同时存在，对于经验不足的使用者而言，选择一个满足需求的算法要花费很大精力。新开发的WindSTORM很好的解决了这个问题，它对不同的分子密度都能提供最佳的定位精度，同时凭借着其非迭代的数值运算特性在GPU上可以实现图像的实时处理。此外，它所采用的背景削减算法能够在不同的背景条件下最大程度的提高成像质量。综上所述，WindSTORM的特性使其成为一个在各种环境下都可以取得优异表现的超分辨率成像重建方法，这对于下一代高通量超分辨率显微成像技术的发展具有重要意义。
参考文献
Ma H, Xu J, Liu Y. WindSTORM: Robust online image processing for high-throughput nanoscopy. Sci Adv. 2019;5(4):eaaw0683.
