随着荧光探针的发展与新型光学成像器件的开发，结合更灵敏的荧光探针与高度集成的头戴式微型化显微成像设备已经在神经科学领域崭露头角。作为革命性的方法，该技术能够对自由活动的啮齿动物、类人灵长类动物的大量神经元进行同时成像，从而可以探索复杂行为表征背后的神经机理与神经疾病的发病机制。近些年，微型化双光子显微成像技术和微型化大视场单光子显微镜的最新进展进一步推动了该领域的发展。
近日，北京大学陈良怡团队在Journal of Neurochemistry期刊上在线发表了一篇综述文章，题为“New imaging instrument in animal models: two-photon miniature microscope and large field of view miniature microscope for freely behaving animals”，讨论了微型化双光子显微成像技术从历史上第一次有记载的尝试到最新的技术进展。作者分别为郭长亮（Changliang Guo）博士、王爱民（Aimin Wang）副教授、程和平（Heping Cheng）院士，通讯作者为陈良怡（Liangyi Chen）教授。这篇文章介绍了以北京大学开发的微型化双光子显微镜为代表的技术进展与发展现状，同时探讨了以加州大学洛杉矶分校为代表的开源微型化大视场显微成像相关技术进展，与它们在神经科学研究中的潜在应用和未来发展潜力。同时，文章讨论了微型化双光子和单光子显微成像数据处理分析技术。最后，文章针对两种技术硬件方面的进一步发展做出了分析和展望。
随着基因编码钙指示剂（GECI）蛋白GCaMP的开发和光学成像技术的快速发展，如多光子、共聚焦，以及光片显微成像技术等已被广泛用于研究头部固定动物大脑神经结构与功能活动[1]。然而，头部固定带来的压力可能会影响动物神经活动模式，进一步导致对大脑的错误解码。虚拟现实设备虽然可以通过模拟真实环境来与动物行为互作，却并不完全等同于在真实环境中的情况[2]。双光子、三光子和单光子微型化显微成像技术规避了头部固定的限制，能够在自由行为动物中以单细胞/亚细胞分辨率成像性能记录神经元的动态活动。文章介绍了微型化显微成像技术在两个方向的发展：实现更高分辨率的微型化双光子显微成像技术和实现大量神经元同时监测的微型化大视场单光子显微成像技术。
微型化显微成像硬件技术进展
1. 双光子微型显微镜
单个突触是大脑中传递、处理和储存信息的基本单位，它与树突的整合是复杂的。然而，微型化单光子宽视场显微镜分辨率性能受离焦背景荧光和脑部组织散射光的限制，无法实现亚微米分辨率。相反，双光子显微镜每次只激发聚焦点部分以消除背景荧光，并通过近红外激发，实现光学切片能力的同时提供深层组织穿透性和减少光毒性。2017年，北京大学程和平院士、陈良怡教授团队开发的高分辨率小型化双光子显微镜（FHIRM-TPM）首次实现了该技术的突破性进展并在全球首次实现了实时观测自由行为小鼠GCaMP6f标记的皮层神经元的树突脊的活动。FHIRM-TPM仅2克左右，高仅1厘米，可实现高空间分辨率（横向0.64微米，纵向3.35微米）与256×256 像素下40赫兹成像速度[3]（图1a）。2021年，北京大学继续报道了FHIRM-TPM 2.0（图1b） 。通过定制设计的的物镜，使成像视场提高 7.8倍（420微米 × 420 微米)，工作距离在水中扩展到1毫米。FHIRM-TPM 2.0的分辨率为横向1.13 微米，纵向12.18 微米。轴向扫描通过整合一个带有快速电调谐透镜（ETL）的Z轴扫描模块来实现的，以实现体积或多平面成像。FHIRM-TPM 2.0可以实现几周的长期记录[4]。随后，挪威科技大学在FHIRM-TPM 2.0的基础上开发了一个更轻的版本，并命名为MINI2P，实现更大的成像视场和更好的Z扫描效果[5]。
图1 北京大学微型化双光子显微镜。（a）第一代FHIRM-TPM；（b）第二代FHIRM-TPM 2.0。 （图源：Guo C, et al., J Neurochem, 2022）
2. 大视场微型显微镜
微型显微镜发展的第二个方向是对大量的神经元群体进行成像。中观尺度的成像推动了神经科学在研究皮层、视网膜和脊髓波发育过程中的研究。然而，对整个大脑区域或跨区域互动的成像仍然具有一定的需求。普林斯顿大学开发的cScope提供了一个成像视场为 7.8 毫米× 4毫米的设计。该设备重33克，以14 微米空间分辨率实现了对大鼠自由过程中脑皮层多个区域神经活动模式的实时监测[6]（图2a）。为了进一步减少微型显微镜的重量和尺寸，同时保持大的成像视场和高分辨率，麻省理工学院J.R. Scherrer等人开发了名为Kiloscope的新型微型显微镜。该系统光学部分由三星Galaxy S9智能手机两个后置摄像头模块拼接而成，仅重1.4克，可以在4.8毫米×3.6毫米的视场范围内进行细胞分辨率成像[7]。然而该系统要实现大范围的实际应用还需要一定的技术改进（图2b）。为了扩大微型化显微镜在大型动物脑部单细胞荧光动态成像中的能力和应用，加州大学洛杉矶分校开发了基于UCLA Miniscope开源平台的微型化大视场显微镜（MiniLFOV）[8]。MiniLFOV 高度为35毫米，重量为13.9克，分辨率为 3.5微米，成像大视场为3.6毫米× 2.7毫米。同时通过采用可调节透镜镜头实现3.5毫米±150微米的工作距离深度调节功能。通过集成一个9轴绝对方向传感器以23赫兹的频率收集头部方位数据，方便研究头部方向相关的神经机制。该设备成功记录了自由活动大鼠海马CA1层CaMP7表达的1300多个神经元活动。同时实现了头部固定小鼠脑皮层区超过约2000个神经元的神经活动。文章同时展示了它的无线数据存储功能。随着同时记录的神经元数量的增加，MiniLFOV有可能产生关于大脑功能的新发现。开源MiniLFOV的建立减少了技术负担和经济成本，使其能够广泛用于全球神经科学界。
图2微型化大视场单光子显微成像技术。（a）普林斯顿大学Cscope；（b）麻省理工Kiloscope；（c）加州大学洛杉矶分校开源MiniLFOV。
（图源：Guo C, et al., J Neurochem, 2022）
微型化显微成像技术总结与展望
神经科学家和成像技术开发者一方面正试图扩大微型双光子显微成像的视场和提高成像速度，而另一方面专注于提高微型化大视场单光子显微镜的分辨率。因此，这两个方向殊途同归，即以实现大视场、高分辨率与三维成像能力为最终目的。超材料镜片是实现该目标的解决方案之一[9]。超材料透镜可以纠正单色像差，进行色差校正，并有足够大的成像视场和微型尺寸，从更好的安装在小型动物脑中，对自由行为动物进行全脑高分辨率成像。同时，基因编码的电压指示剂也在快速的发展[10]。电压指示剂可以实现接近电生理的时间分辨率，通过与光学成像系统的结合达到单细胞分辨率、大视场、kHz时间分辨率成像。最后，微型化显微成像系统可以通过结合光遗传技术对选定的细胞实现毫秒级有针对性的激发或抑制[11]，可用于神经类疾病，如癫痫的抑制与治疗。最后，通过与光遗传学相结合，系统可以实现闭环控制，即实现实时解码干预神经活动模式，为脑机交互与脑机接口奠定基础。
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36281555/
参考文献
1. Denk, W., Strickler, J. H. & Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science (1990) doi:10.1126/science.2321027.
2. Aghajan, Z. M. et al. Impaired spatial selectivity and intact phase precession in two-dimensional virtual reality. Nature Neuroscience 18, (2015).
3. Zong, W. et al. Fast high-resolution miniature two-photon microscopy for brain imaging in freely behaving mice. Nature Methods (2017) doi:10.1038/nmeth.4305.
4. Zong, W. et al. Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging. Nature Methods (2021) doi:10.1038/s41592-020-01024-z.
5. Zong, W. et al. Large-scale two-photon calcium imaging in freely moving mice. Cell 185, (2022).
6. Scott, B. B. et al. Imaging Cortical Dynamics in GCaMP Transgenic Rats with a Head-Mounted Widefield Macroscope. Neuron 100, (2018).
7. Scherrer, J. R., Lynch, G. F., Zhang, J. J. & Fee, M. S. A Novel Optical Design Enabling Lightweight and Large Field-Of-View Head-Mounted Microscopes. bioRxiv 2021.09.03.458947 (2021).
8. Guo, C. et al. Miniscope-LFOV: A large field of view, single cell resolution, miniature microscope for wired and wire-free imaging of neural dynamics in freely behaving animals. bioRxiv 2021.11.21.469394 (2021) doi:10.1101/2021.11.21.469394.
9. Chen, W. T. et al. A broadband achromatic metalens for focusing and imaging in the visible. Nature Nanotechnology 13, (2018).
10. Flytzanis, N. C. et al. Archaerhodopsin variants with enhanced voltage-sensitive fluorescence in mammalian and Caenorhabditis elegans neurons. Nature Communications 5, (2014).
11. Fenno, L., Yizhar, O. & Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review of Neuroscience 34, (2011).
文章来源：逻辑神经科学 ，作者陈良怡，郭长亮
