定义
基于共聚焦测量原理的具有增强深度分辨率的光学显微镜。
共聚焦显微镜是扫描显微镜，其主要特征是通过抑制相当薄的平面外的光的图像贡献，显着提高纵向（轴向）分辨率。 这允许人们获取三维图像，例如透明的生物和医学样品 - 有效地应用一种“光学切片”而不是样品的物理切片。 例如，使用这种显微镜，人们甚至可以观察到活细胞内的微小细节。 因此，这些仪器对于生物和医学研究以及各种其他研究和工业检查领域变得很重要。
共聚焦显微镜的原理也应用于一些光学轮廓仪。
共聚焦显微镜的工作原理
在传统的光学显微镜中，通过使用具有短焦距和高数值孔径的显微镜物镜可以实现相当高的横向图像分辨率（远低于1μm）。 然而，剩下的问题是，来自透明样品中不同纵向位置的光会影响图像，导致纵向分辨率有限。 由于物体平面外的光的贡献（通过焦点调整选择）失焦，即强烈模糊，因此获得了一些有限的抑制量。
通过利用共聚焦显微镜的原理可以获得显着增强的纵向（轴向）分辨率，共聚焦显微镜是由Marvin Lee Minsky在1950年代发明并获得专利的[2]，即在激光发明之前。 （共聚焦原理实际上更早地就被认识到了[1]，但显然这个术语是在1977年[5]，在对共聚焦显微镜的工作原理进行彻底的理论分析的背景下才被引入的。
图1：共聚焦激光显微镜的设置。
现代形式的共聚焦扫描显微镜（见图1）的工作原理如下：
- 使用显微镜物镜（点照明而不是整个物体的照明）将衍射极限准直激光束紧密聚焦到样品上。
- 从焦点返回的光（例如，通过样品中的散射或荧光光）被成像到一个小针孔并传输到光电探测器。
- 记录的强度仅传达单个物体点的信息。 通过系统地平移光束焦点（使用某种激光扫描仪，例如使用振荡镜）或样品，扫描样品中的某个区域或体积（飞点显微镜），获得完整的二维或三维图像。
来自样品中其他纵向或横向位置的光在很大程度上受到抑制：
- 在其他横向位置，几乎没有任何入射激光，除了由于光束发散而引起的光束聚焦前后的激光。 此外，这种光无法穿过针孔，因为它会聚焦到远离孔的点。
- 来自样品中光束焦点上方或下方位置的光也不能很好地穿过针孔，因为它的焦点位置不在针孔的平面上（所选的光学共轭平面）。 此外，由于光束发散很大，激光强度会迅速变小。
必须确保调整针孔，以便从激光束焦点精确地收集光线。
光电探测器记录的获得的光功率通常相当小。 因此，通常使用光电倍增管或雪崩光电二极管等灵敏检测器来限制所需的曝光时间。
共聚焦显微镜的原理可以通过多种方式进行修改：
- 对于透射操作，激光照射可以通过样品另一侧的第二个显微镜物镜完成。
- 可以使用光束路径的角度分离进行照明和检测，增强弱散射物体（例如纳米颗粒）的成像。 这种“角门控”的想法导致了选择平面照明显微镜（SPIM），也称为正交平面荧光光学切片（OPFOS）。
- 针孔可以用单模光纤的末端代替，作为照明和检测的光学孔径[10，11]。 这一原理造就了特别灵活的显微镜。
- 在某些样品（SHG或THG显微镜）中可以采用二次谐波产生[7]或第三次谐波产生[13]。 在这种情况下，必须在激光束方向上进行检测。
- 共聚焦显微镜的横向分辨率通常与传统光学显微镜相似，受衍射限制在光学波长的一半量级。 然而，在一些基于受激发射耗尽显微镜（STED显微镜）原理的荧光显微镜中可以实现亚衍射分辨率（导致纳米学的超分辨率）；有关更多详细信息，请参阅有关荧光显微镜的文章。
使用尼普科光盘扫描
在1960年代，Mojmir Petran和Milan Hadravsky发明了一种新的共聚焦显微镜扫描技术（串联扫描显微镜）。 他们使用Nipkow圆盘，这是一种具有数千个针孔螺旋图案的圆盘。 在操作过程中，该圆盘被旋转，因此样品中的许多移动点同时被照亮，这有助于大大减少整体曝光时间。 收集的光也通过光盘（或者通过第二个同步旋转的光盘）并到达电子图像传感器，该传感器可以同时测量对应于多个针孔的强度。
第一台商用共聚焦扫描显微镜是基于Nipkow圆盘的原理。
该方法得到了进一步发展，用电子控制的空间光调制器（可编程阵列显微镜，PAM）取代了旋转盘。
共聚焦显微镜的光源
现代共聚焦显微镜通常使用某种激光，因为它的高空间相干性非常适合紧密聚焦到样品中的小点。 然而，原则上，人们也可以使用非相干光源，其中辐射首先需要聚焦到额外的针孔，然后准直；这是在早期的共聚焦显微镜中完成的。 然而，这样，人们就会失去大部分的光功率。 第一台扫描激光显微镜（带有氦氖激光器）于1969年在耶鲁大学展出[3]。
许多共聚焦显微镜使用连续波激光器，但一些荧光显微镜需要锁模激光器（超快激光器），发射超短脉冲进行双光子激发或多光子荧光激发。
参考文献
[1] H. Goldmann, “Spaltlampenphotographie und -photometrie”, Ophthalmologica 98 (5/6), 257 (1940)
[2] Marvin Minsky, “Microscopy Apparatus”, US Patent 3.013.467, granted in 1961
[3] P. Davidovits and M. D. Egger, “Scanning laser microscope”, Nature 223 (5208), 831 (1969), doi:10.1038/223831a0
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[17] Nature Photon. 3 (7), special issue on super-resolution imaging (2009)
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[19] C. J. R. Sheppard, “Confocal Microscopy. The Development of a Modern Microscopy”, Imaging & Microscopy (online, 2009)
