荧光光谱 Fluorescence spectroscopy

2022-11-25 10:05:36 浏览:251

定义

基于荧光分析的光谱学。

荧光光谱学是指一类基于荧光分析的光谱学方法,特别是关于发射光谱的分析。 荧光的特性经常用于识别物质,通常包括它们的浓度,在其他情况下,影响荧光细节的介质特性。

有时使用术语荧光光谱法代替光谱法,以强调以定量方式测量某些量。

与吸收光谱相比,通常不测量施加的激发光会发生什么(例如其吸光度),而只观察荧光发射的性质。

操作原则

荧光通过用来自某些光源的光照射样品来主动激发,该光源是荧光计(或荧光计)的一部分。 (在许多情况下,人们使用紫外线。 此外,还有某种光电探测器,它可以与可调谐单色器(或有时只有几个简单的光学滤光片)结合使用以进行光谱分析。 图2显示了荧光计设置的示例。

荧光光谱 Fluorescence spectroscopy

图1:由单个波长的光激发引起的多个波长的荧光激发。

样品中的一些荧光团通常通过线性吸收(每个吸收过程一个光子)吸收入射激发光,但也存在利用高光强度的非线性吸收的情况,例如双光子吸收甚至多光子吸收,即每个激发过程有两个或多个光子。 吸收导致原子、离子或分子激发到某些激发的电子状态。 通常,激发物体首先经历一些非辐射跃迁到较低的激发态(见图1)。 最后,有一定概率会有光子从激发态发射到电子基态或另一个激发态,在后一种情况下,光子能量相应降低,随后可能发射一个或多个额外的光子。 也有共振荧光的情况,不涉及额外的电子跃迁,发射波长接近激发波长。 部分荧光可能被淬灭。

在自由分子中,例如在气体光谱中,所涉及的激发态可以涉及振动和旋转状态。 在固体材料的情况下,与相邻原子的相互作用可以显着改变产生的荧光。 同样,液体中也存在溶剂相互作用。

荧光光谱 Fluorescence spectroscopy

图2:设置带有脉冲激光、单色器和快速光电探测器的荧光光谱仪(分光荧光计)。其它设置可能包含宽带光源和激发单色器或另一种检测器,例如具有多通道检测器的光谱仪。

某些类型的样品含有天然种类的荧光团,这些荧光团可以是某些较大分子或单独的荧光分子的一部分。 例如,酪氨酸和色氨酸存在于生物样品中。 在其他情况下,以某种荧光染料(通常是芳香族化合物,如荧光素)的形式添加荧光团,这有助于揭示样品的某些特性。 例如,某些染料优先附着在某些结构上,因此可以作为这些结构的标记。 这种方法特别用于荧光显微镜,例如用于生物学研究,其中可以标记生物细胞内的某些结构。

在大多数情况下,激发波长(或宽带激发光谱)保持固定。 然而,也有一些方法,通过一定范围扫描激发波长,有时只检测荧光的整体光功率(不进行光谱分析)。 然后,人们关注激发机制的细节,而不是光发射的细节。 当将可变激发波长与荧光的全光谱分析相结合时,可以获得最大的灵活性。

激发光可以是连续波源或脉冲源:

  • 对于连续激发,可以主要根据其光谱分析荧光,有时也分析偏振。
  • 对于脉冲激发,还可以测量荧光寿命(衰减时间) - 完整光或特定光谱分量。 荧光寿命(例如在纳秒或微秒区域)可以传达额外的光谱信息。 例如,固体中某些离子的荧光在接近某些晶体缺陷或杂质时可能会被淬灭。

荧光光谱仪的仪器可以称为分光荧光计。 (也有更简单的荧光计或没有光谱分辨率的荧光计。 除了用于实验室的高性能仪器外,还有更紧凑的仪器,即使是手持式电池供电设备的形式。

激发和/或光检测可以限制在样品上的小体积。 以高空间分辨率测量的荧光光谱可以称为荧光显微镜。

荧光光谱光源

根据所选择的方法,可以使用不同种类的光源进行荧光光谱分析:

  • 简单的光源,如某些气体放电灯(如汞蒸气灯)可用于产生具有连续或脉冲发射的紫外线。 然后,通常需要某种光学带通滤波器来限制光谱范围。 还有一些带有激发单色器的源,在测量过程中可以使用该源扫描一定范围。
  • 在某些情况下,即使是发光二极管(LED)也足够了。 这允许廉价和紧凑的解决方案,特别是对于便携式仪器。
  • 不同类型的激光器是特别强大的激发源,因为可以处理很宽的光谱范围,包括紫外线,然后通常在非线性晶体中以倍频产生。 用具有窄光带宽(线宽)的光进行激发可能会很有趣。 此外,使用脉冲激光器可以轻松获得持续时间为几纳秒甚至皮秒或飞秒的短脉冲。
  • 对于波长变化很大的激发,可以使用可调谐激光器或光学参量振荡器(OPO),或者如上所述将宽带源与激发单色器结合使用。 在后一种情况下,可用的激发强度当然远小于激光。

如果使用的光源不能产生具有精确恒定的光功率或脉冲能量的光,也可以使用额外的光电探测器测量其输出,并使用其输出信号来消除荧光测量结果中的功率波动。

光电探测器

根据要求,可以使用不同种类的光电探测器。 对于具有连续波激发和扫描单色器的仪器,只需要在相关光谱范围内具有高灵敏度的光电探测器 - 例如,某种类型的光电二极管。 与用于最佳杂散光抑制的双单色器结合使用时,需要暂时更高的检测器灵敏度。

另一种可能性是使用一种包含衍射光栅和线性光电二极管阵列的光谱仪或具有空间分辨率的其他类型的光电探测器。 当使用二维传感器时,例如用作图像传感器,可以结合光谱分辨率实现一维空间分辨率。

对于荧光寿命测量,除了高灵敏度外,还需要快速响应(高带宽)。 这缩小了合适探测器的选择范围;人们经常使用光电倍增管或雪崩光电二极管。 还有一些包含微通道板的设备。

各种问题

人们通常试图消除激发光对检测器的任何直接影响,例如通过光谱辨别,也可能使用其他方法,例如通过在预期激发光很少的方向上进行检测,例如垂直于透明样品中的激发光束。 特别是在荧光比激发光弱得多的情况下,或者当样品强烈散射激发光时,需要在检测系统中强抑制激发光。 例如,可能需要使用双单色器。

为了有效地从样品收集光,例如到单色器的输入狭缝,可以使用柱面透镜。

获得的荧光光谱可以通过样品内的进一步相互作用来改变,例如通过波长依赖性吸收。 通过使用薄样品可以最大限度地减少这种影响。

除了荧光光外,还可能存在拉曼散射产生的光,这也表现出一些斯托克斯位移。

在某些情况下,紫外激发光会导致样品的降解(例如通过光分解)。 因此,高度灵敏的检测是特别可取的,因为它可以减少曝光时间。

有时,不仅需要监测来自某种荧光团的荧光量,还需要精确检测发射光谱的微小变化,例如由于样品中的细微相互作用。 在这种情况下,可能需要特别高的光谱分辨率和低检测噪声。

应用

荧光光谱通常用于化学、生物学和环境监测。 一些例子:

  • 工业产品,例如石油工业,或药品可以通过检测荧光进行监测,例如为了检测杂质。 人们可以识别物质并测量其浓度。
  • 类似的应用是环境监测,例如在水样或空气中。
  • 通过荧光光谱可以检测和区分引起危险感染的各种细菌、病毒、真菌和寄生虫。 此外,微生物抗生素敏感性的生物医学研究可以从这种方法中受益。
  • 另一个应用是人体组织中的癌症诊断。 例如,人们可能会用一种物质渗透到样本中,该物质优先积聚在肿瘤中,然后可以通过激光诱导荧光进行检测。
  • 如上所述,荧光标记物广泛用于生物学研究的荧光显微镜。

时间分辨荧光光谱可用于获得大量额外信息,因此对某些基础科学研究领域具有重要意义。

方法

作          者: 泮桥成像光电商城

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