定义
全内反射荧光显微成像（TIRFM）是利用全反射过程中的倏逝波对生物样本表层（约100 nm以内）成像的荧光显微镜。
全反射
如图1所示，有两种不同介质，其折射率分别为n1和n2 ，且n1 > n2。一束光从介质1入射，在两介质分界面上发生折射，入射角和折射角分别为
、
。根据折射定律有：
当
较小时，
；此后随 逐渐增大， 越来越接近90°，并最终达到90° 。此时的入射角称为临界角，记作
。由折射定律可得 
。当
时，折射光不存在，这种现象被称为全反射。
倏逝波
根据经典电磁理论，在发生全反射时，介质2（波疏介质）中在分界面附近依然存在一定光场分布，这一光场被称为倏逝场。它的特点是光强随到分界面的距离（深度）指数衰减，数学形式如下：
其中I(z) 为深度z处的光强，I0 为分界面处的光强，z0 为表征光强衰减速度的特征深度，表达式为
，其中λ为入射光在真空中的波长。在z = z0处，光强降至 I0 的36.8%；在z = 2z0处，光强降至 I0 的13.5%。
TIRF显微镜成像原理
TIRF显微镜成像原理如图2所示。折射率较小的生物荧光样本被置于折射率较大的玻片上，激光从玻片以大于临界角 的角度入射，在玻片-样本分界面上发生全反射，因此在样本表面会形成倏逝波。
图 2 TIRF显微镜成像原理示意图
由于倏逝波的光强随深度增大指数衰减，只有样本表层很小范围内的荧光分子会被激发，这些荧光分子激发出的光子被后续光路接收后成像。因此TIRF显微镜一般用于拍摄发生在细胞膜上及附近的生命活动，例如囊泡分泌，而且具有很高的轴向分辨率，一般能达到100 nm以内。
参考来源
[1] https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/total-internal-reflection-fluorescence-tirf-microscopy
参阅：显微物镜、荧光显微成像
