全内反射荧光显微成像

2021-04-12 13:23:05 浏览:824

定义

全内反射荧光显微成像(TIRFM)是利用全反射过程中的倏逝波对生物样本表层(约100 nm以内)成像的荧光显微镜。

全反射

如图1所示,有两种不同介质,其折射率分别为n1和n2 ,且n1 > n2。一束光从介质1入射,在两介质分界面上发生折射,入射角和折射角分别为。根据折射定律有:

较小时,;此后随 逐渐增大, 越来越接近90°,并最终达到90° 。此时的入射角称为临界角,记作。由折射定律可得  。当 时,折射光不存在,这种现象被称为全反射。

倏逝波

根据经典电磁理论,在发生全反射时,介质2(波疏介质)中在分界面附近依然存在一定光场分布,这一光场被称为倏逝场。它的特点是光强随到分界面的距离(深度)指数衰减,数学形式如下:

 

其中I(z) 为深度z处的光强,I0 为分界面处的光强,z0 为表征光强衰减速度的特征深度,表达式为 ,其中λ为入射光在真空中的波长。在z = z0处,光强降至 I0 的36.8%;在z = 2z0处,光强降至 I0 的13.5%。

TIRF显微镜成像原理

TIRF显微镜成像原理如图2所示。折射率较小的生物荧光样本被置于折射率较大的玻片上,激光从玻片以大于临界角  的角度入射,在玻片-样本分界面上发生全反射,因此在样本表面会形成倏逝波。

图 2 TIRF显微镜成像原理示意图

由于倏逝波的光强随深度增大指数衰减,只有样本表层很小范围内的荧光分子会被激发,这些荧光分子激发出的光子被后续光路接收后成像。因此TIRF显微镜一般用于拍摄发生在细胞膜上及附近的生命活动,例如囊泡分泌,而且具有很高的轴向分辨率,一般能达到100 nm以内。

参考来源

[1] https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/total-internal-reflection-fluorescence-tirf-microscopy

参阅:显微物镜、荧光显微成像

荧光成像

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