双光子激发为二阶过程，单位时间内每个分子对双光子的吸收概率 
正比于双光子吸收截面 
以及入射光强
的二次方。
关系式：
对于双光子点扫描显微镜，激光以聚焦光的形式汇聚在样本上。聚焦激发光光强与功率的关系式：
考虑到任何的探测器都有响应速度的限制，单位时间内的双光子激发概率为：
对于连续激光光源，即 
，单位时间内的双光子激发概率为：
对于飞秒激光光源，设其重复频率
，脉宽为 
，峰值功率
，平均功率
。
单位时间内的双光子激发概率为：
激发完全相同的荧光样本时，将这两者的参数分别双光子激发概率公式：
对于连续激光输出，如图1所示：
对于飞秒激光器输出，如图2所示：
|
图 1 连续激光输出 |
图 2 飞秒激光输出 |
结论
（1）利用飞秒激光可以将双光子的激发效率提高
倍。这也就是为什么双光子显微镜要求使用高峰值功率的脉冲激光作为激光光源，并且要保证在样本处的脉宽足够小的原因。
（2）双光子激发概率与物镜数值孔径
成正比，所以一般要求激光汇聚的
足够高，即将激光汇聚到足够小的区域内，才能提高双光子的激发概率。
参考文献
[1] 宗伟健. 微型双光子显微镜及自由活动小鼠神经成像[D].中国人民解放军军事医学科学院,2017.
[2] M. Göppert-Mayer. Elementary processes with two quantum transitions[J]. Annalen der Physik, 2009, 18(7-8):466-479.
[3] Denk W, Strickler J, Webb W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy[J]. Science, 1990, 248(4951):73-76.
[4] Zipfel W R , Williams R M , Webb W W . Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences[J]. Nature Biotechnology, 2003, 21(11):1369-1377.
