背景
1979年Ｃatalano等人首先在低温下使用ＰＭＴ对无机材料Pb12和CdS的三光子非线性光学性质进行了定量的分析。1995年，Ｄavey等人首次在有机高分子聚合物溶液中观察到了三光子激发的荧光现象，并定量 分析了三光子吸收截面，由此提出了利用该原理将近红外辐射转化为可见光的设想。随后Hell等使用２，５-双（４-联苯基）唑（ＢＢＯ）晶体，成功实现了这一设想；同时，他们还结合Gryczynski等在钙染料Indo-1和一些蛋白质中观察的到三光子激发现象，提出了将三光子荧光激发用于显微成像这一重要的应用方向。1996年，Xu等人使用锁模Ti-Sapphire激光器对分离中期染色体进行双光子和三光子成像，并对这两种成像技术进行了比较，验证了三光子成像与双光子成像一样具有逐层扫描样品并进行３Ｄ重建的能力。尽管人们在1990年即认识到了三光子成像的潜力，并开始开发这项技术，但充分发挥三光子成像的优势则需要瞬时功率更高、波长更长的激光光源，这使得三光子成像技术严重受限于当时的光源技术和成本。
典型系统
人们一直对三光子成像的光源进行探索，期望找到更合适的光源。研究者们尝试了如Cr Fosterite激光器、光参量振荡器（OPO）、孤子自频移（SSFS）等方法来产生更长的波长和更大的功率。其中，最重要的突破是Horton等人于2013年所报道的一种使用基于SSFS光源的三光子显微镜[1]，如图1所示。该结构中关键的光源部分由光纤激光器、光子晶体 杆和长通滤波器组成；在工作时，首先由光纤激光器产生1550nm的激光（脉宽360fs，频率１ＭＨｚ），在该光束通过光子晶体杆的过程中，由于孤子自频移效应，该光束的波长会红移至1700nm，同时通过形成孤子获得100 000倍的能量提高和６倍的脉宽压缩（脉宽65fs，脉冲能量500ｎＪ），并通过长通滤波器滤除原激光器的光后作为成像光源使用。如图2所示，可以看到该三光子系统的成像深度和分辨率均比较理想，可以无损地看到大脑灰质之下的白质。
除改进光源外，研究者们也在通过其他方法进一步提高三光子显微镜的性能。传统的点扫描 成像模式虽然可以获得较高的分辨率和信噪比，但这样获取一张图片的时间大约需几十毫秒，无法应用于需要在短时间内激发很多荧光基团的技术中，如光遗传学和高通量成像。Rowlands等人基于时间聚焦激光脉冲[2]，实现对特定区域的同时照明，实现三光子宽场成像；与宽场双光子成像相比，该方法具有更大的成像深度，且可以精确控制照明范围以同时激活在特定组织深度和区域内的光敏感通道，使得在组织内部进行光遗传学研究成为可能。
图 1 三光子显微成像系统原理图
图 2 三光子显微成像结果（a）脑部血管 （b）神经元
三光子成像与双光子成像对比
三光子成像是一项具有广泛应用和发展前景的显微成像技术。与双光子成像相比（见下表），由于三光子成像使用了波长更长的激发光源，从而很大程度上提升了成像深度—这与长波激发光在组织中的散射更低有关，但更重要的是因为三光子成像可以采用的1600-1800nm的激发光，能够避开组织中水对红外光的吸收峰，从而更好地穿透组织；同时，发生三光子吸收需要更高的激光能量，来自非焦平面的背景信号能被进一步削弱，从而可以提高信号背景比，获得更高质量的图像[3-7]。
参考文献
[1] Horton N G , Wang K , Kobat D , et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain[J]. Nature Photonics, 2013, 7(3):205-209.
[2] ROWLANDSCJ, PARKD, Brunsot, et al, Wide field three photon excitation in biological samples[J]. Light siceng& Applications, 2016, 5:e16255
[3] 石玉洁,张广杰,陆政元, et al.新型多光子成像技术研究进展[J].中国光学,2018,11(003):296-306.
[4] Zipfel W R , Williams R M , Webb W W . Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences[J]. Nature Biotechnology, 2003, 21(11):1369-1377.
[5] Svoboda K , Yasuda R . Principles of Two-Photon Excitation Microscopy and Its Applications to Neuroscience[J]. Neuron, 2006, 50(6):823-83
[6] Hell, Stefan W . Three-photon excitation in fluorescence microscopy[J]. Journal of Biomedical Optics, 1996, 1(1):71.
[7] Huland D M , Jain M , Ouzounov D G , et al. Multiphoton gradient index endoscopy for evaluation of diseased human prostatic tissue ex vivo[J]. Journal of Biomedical Optics, 2014, 19.
