荧光成像

2021-04-14 10:58:16 浏览:707

荧光

荧光是自然界常见的一种发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光(通常是紫外线或X射线)照射,吸收光能后进入激发态,并且立即退激发并发出出射光(通常波长比入射光的的波长长,在可见光波段);而且一旦停止入射光,发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。一般以持续发光时间来分辨荧光或磷光,持续发光时间短于秒的称为荧光,持续发光时间长于 秒的称为磷光。在日常生活中,人们通常广义地把各种微弱的光亮都称为荧光。

荧光是光子与分子的相互作用产生的,这种相互过程可以通过雅布隆斯基(Jablonslc)分子能级图描述:大多数分子在常态下,是处于基态的最低振动能级So,当受到能量(光能、电能、化学能等等)激发后,原子核周围的电子从基态能级So跃迁到能量较高的激发态(第一或第二激发态),激发态的电子处于高能量状态,不稳定,会通过两种途径释放能量回到基态,一种是以光子形式释放能量的辐射跃迁(包括荧光和磷光过程),一种是以热能等形式释放能量的非辐射跃迁。通常原子核外电子受到激发从基态So跃迁到激发态Si后,会通过非辐射跃迁的方式快速降落在最低振动能级,随后由最低振动能级回到基态,以光子辐射的形式释放出能量[1-2]。原子荧光可分为3类:即共振荧光、非共振荧光和敏化荧光,其中以共振原子荧光最强,在分析中应用最广。共振荧光是所发射的荧光和吸收的辐射波长相同。只有当基态是单一态,不存在中间能级,才能产生共振荧光。非共振荧光是激发态原子发射的荧光波长和吸收的辐射波长不相同。非共振荧光又可分为直跃线荧光、阶跃线荧光和反斯托克斯荧光。直跃线荧光是激发态原子由高能级跃迁到高于基态的亚稳能级所产生的荧光。阶跃线荧光是激发态原子先以非辐射方式去活化损失部分能量,回到较低的激发态,再以辐射方式去活化跃迁到基态所发射的荧光。直跃线和阶跃线荧光的波长都是比吸收辐射的波长要长。反斯托克斯荧光的特点是荧光波长比吸收光辐射的波长要短。敏化原子荧光是激发态原子通过碰撞将激发能转移给另一个原子使其激发,后者再以辐射方式去活化而发射的荧光[1-2]

参数

对荧光特性进行表征的参数有荧光光谱、荧光强度、荧光量子效率、荧光寿命、斯托克斯(位移)等。

荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况,也就是不同波长的激发光的相对效率;发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况,也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。

荧光强度指发射荧光的光强度。

荧光量子效率又称又称荧光量子产额,荧光效率。定义为单位时间(秒)内,发射二次辐射荧光的光子数与吸收激发光初级辐射光子数之比值。荧光量子效率荧光物质诸性能之中是一个最基本而重要的参数,它表示物质将吸收的光能转变成荧光的本领。他的大小是与物质的化学结构紧密相关的,任何影响以至于改变物质化学结构的因素都会导致荧光量子效率的改变,恒温下,可以说功,是分子结构的“函数”。为了弄清分子结构及其变化的情况,特别是那些有些微差别的化合物分子结构,荧光量子效率可提供相关信息。

荧光寿命是指当某种物质被一束激光激发后,该物质的分子吸收能量后从基态跃迁到某一激发态上,再以辐射跃迁的形式发出荧光回到基态。当不施加激发光后,分子的荧光强度降到激发时的荧光最大强度的1/e所需要的时间,常用τ表示。荧光分子寿命的测试方法有时间相关单光子记数法,频闪技术,相调制法,条纹相机法,上转换法等。根据激发态寿命理论,物质的荧光寿命主要由自发辐射跃迁寿命和无辐射跃迁寿命来决定。自发辐射寿命与温度无关,但对环境的扰动敏感。在环境扰动下,例如,和体系的任何其它分子碰撞,体系可能通过非辐射过程失去其电子的激发能量。任何一种趋于和自发发射过程相竞争的过程都会降低激发态寿命。荧光物质的荧光寿命与自身的结构、所处微环境的极性、粘度等条件有关,因此通过荧光寿命测定可以直接了解所研究体系发生的变化。荧光现象多发生在纳秒级,这正好是分子运动所发生的时间尺度,因此利用荧光技术可以“看”到许多复杂的分子间作用过程,例如超分子体系中分子间的簇集、固液界面上吸附态高分子的构象重排、蛋白质高级结构的变化等。除了直接应用之外,荧光寿命测定还是其它时间分辨荧光技术的基础。例如基于荧光寿命测定的荧光猝灭技术可以研究猝灭剂与荧光标记物或探针相互靠近的难易,从而对所研究体系中探针或标记物所处微环境的性质作出判断。

斯托克斯位移表现为荧光光谱较相应的吸收光谱红移。由于斯托克斯位移的产生,荧光发射波长总是大于激发光波长,并因斯托克斯在1852年首次观察到而得名。固体吸收光子的能量将大于辐射光子,因此发光光谱与吸收光谱相比,将向能量较低的方向偏移(红移),两个光子能量的差值。激发峰位和发射峰位的波长之间的差是一个表示分子发光特性的物理常数,这个常数被称为斯托克斯位移。它表示分子在回到基态以前,在激发态寿命期间能量的消耗。

激发态分子通过内转换和振动弛豫过程而迅速到达第一激发单重态的最低振动能级,是产生斯托克斯位移的主要原因。荧光发射可能使激发态分子返回到基态的各个不同振动能级,然后进一步损失能量,这也产生斯托克斯位移。此外,激发态分子与溶剂分子的相互作用,也会加大斯托克斯位移。

实验中荧光发射光谱、激发光谱和荧光强度等参数的测量可以利用荧光光谱仪实现[3-5]

荧光成像

基于生物荧光参数测量,进行生物成像的技术被称为生物荧光成像技术。生物荧光成像技术能够在三维尺度上对生物分子、细胞及组织/器官进行实时、可视化的检测,能跟踪生物体的各种生理过程,了解生物分子及其结构与功能的关系,已成为当前生物医学领域的一个重要工具。荧光成像技术具有非侵入、可视化、高时空分辨率、安全和快速等优势,已被广泛用于肿瘤诊断 、生物分子检测、药物分布和代谢等诸多领域。

荧光成像的理论基础是荧光物质被激发后所发射的荧光信号的强度在一定的范围内与荧光素的量成线性关系。常用的荧光成像系统包括荧光信号激发系统(激发光源、光路传输组件)、荧光信号收集组件、信号探测系统。光源可选激光光源和发光二极管光源。其中,激光光源为单波长非连续光,分辨率和灵敏度高。二极管光源相对激光光源结构更紧凑简洁,激发光带宽较宽,能量输出相对较低,可以直接整合到图像扫描设备内。荧光信号收集系统主要包括振镜式的扫描系统和摆头式扫描系统。振镜式的扫描系统通过快速摆动反射镜将反射光信号捕获,而摆头式扫描系统通过平移探头来实现等距信号的捕获。荧光信号探测系统比较普遍的荧光信号探测装置包含PMT光电倍增管和视觉相机(包含电荷耦合元件CCD和互补金属氧化物半导体)。PMT光电倍增管将放大后的光信号转化为电信号,放大倍数通常在10-6---10-7数量级,转化波长范围一般在300-800nm之间;视觉相机是荧光成像应用越来越普遍的成像组件,用在荧光成像的产品主要有EMCCD、ICCD、SCMOS相机和制冷相机产品。

目前生物医学研究领域广泛使用的许多商用荧光成像光学成像系统,如共聚焦荧光显微系统、双光子激光扫描显微系统、全内反射荧光显微系统、荧光共振能量转移成像系统、荧光寿命成像显微系统等都是基于物质荧光的成像技术[6-8]

参考文献

[1] https://baike.baidu.com/item/荧光成像/17449528?fr=aladdin
[2] 王丹. 基于荧光纳米粒子的一些生物功能成像研究[D].浙江大学,2013.
[3] Neil Withers. Fluorescence imaging: Go with the glow[J]. Nature Chemistry, 2008.
[4] Lichtenthaler H K , Joseph A. Miehé. Fluorescence imaging as a diagnostic tool for plant stress[J]. Trends in Plant Science, 1997, 2(8):316-320.
[5] Lichtman J W , José-Angel Conchello. Fluorescence microscopy[J]. Nature Methods, 2005, 2(12):910.
[6] 王晓驰, 常刚, 曹瑞军, et al. 近红外荧光染料的结构、性质及生物荧光成像应用[J]. 化学进展, 2015(07):20-31.
[7] Ishiguro H , Horimizu T . Three-dimensional microscopic freezing and thawing behavior of biological tissues revealed by real-time imaging using confocal laser scanning microscopy[J]. International Journal of Heat and Mass Transfer, 2008, 51(23-24):5642-5649.
[8] Kobat D , Durst M E , Nishimura N , et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation[J]. Optics Express, 2009, 17(16):13354-13364.
[9] Kobat D , Horton N G , Xu C . In vivo two-photon microscopy to 1.6-mm depth in mouse cortex[J]. Journal of Biomedical Optics, 2011, 16(10):106014.

荧光成像

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