基本介绍
荧光寿命检测是指利用时间分辨技术来检测荧光强度衰减的动态过程。在高能量光的激发下，荧光物质会跃迁至不稳定的激发态，在其返回至稳定基态的过程中会辐射出荧光光子。所以，荧光寿命反映了荧光物质在激发态停留的平均时间。类似于荧光光谱，荧光寿命是荧光物质的另一项重要特性。荧光寿命探测突破了传统稳态荧光探测的限制，为荧光成像增加了一个独立维度的全新信息。由于荧光团从激发态到基态的跃迁过程极易受分子局部环境的影响，所以荧光寿命还能够灵敏地反映分子所处环境的PH、温度、氧浓度、离子浓度、酶活性以及分子构型等。例如，自由态还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的荧光寿 命为几百皮秒，而蛋白绑定NADH 则有几个纳秒的荧光寿命。另外，荧光寿命测量通常独立于荧光物质的浓度和量子产率。
因此，利用时间分辨荧光探测技术研究生物系统具有诸多独特优势：
- 荧光寿命特性为区分发射光谱重叠的荧光物质提供了一个额外的对比参数，使得光谱重叠但荧光衰减时间不同的生物分子能够得到有效分辨；
- 荧光寿命测量对生物组织微环境各项参数的敏感性使其能够用于检测局部环境参数和研究蛋白之间的相互作用；
- 由于组织中荧光物质的浓度通常是未知的、不断变化的，因而荧光寿命独立于荧光物质浓度和量子产率的特性使其相比于稳态荧光探测技术，能够实现更为准确的在体定量测量。基于以上优势，荧光寿命成像技术获得了研究人员的极大关注，该技术已被广泛应用于生物物理学和医学诊断研究中.
双光子显微成像技术与荧光寿命探测技术的结合开创了一个优势互补的共赢局面。一方面，双光子显微成像技术不仅能够提供荧光寿命探测所需的脉冲激发光源，而且得益于其固有的层析能力，该技术能够有效避免对厚组织进行荧光寿命测量时，不同深度信号之间的串扰；另一方面，与荧光寿命探测技术的结合使得双光子显微成像技术能够提供多个维度的荧光信号探测模式，无论是功能还是应用范围都得到了拓展，进而为生物医学以及临床诊断提供了一种全新的研究手段。
双光子荧光寿命主要检测方法
目前，国际上已经发展了一系列能够与双光子显微成像结合起来的荧光寿命检测技术。从信号处理的角度出发，这些技术大致可以分为频域检测技术和时域检测技术两类。
频域检测技术采用经过调制的激发光激发样品，并通过测量在一个或多个调制频率下荧光信号相对于调制激发光的相移和调制度来计算荧光寿命。样品产生的荧光信号与经过调制的激发光具有相同的频率，但相位会发生延迟，调制度降低。值得注意的是，频域技术能够适应较宽的荧光强度变化范围，耐受极高的荧光强度，但是在荧光较弱的情况下，其探测效率会急剧下降。这涉及到复杂的电子设计原理及相关应用。
时域技术直接记录荧光分子被一个极短的脉冲光激发之后，其荧光强度随时间的变化过程，即荧光衰减曲线，可通过对其进行单指数或多指数拟合计算出荧光寿命。从电子学角度来讲，具体的记录方法又可以分为模拟技术和数字（光子计数）技术两类。模拟技术将探测信号视为一个连续的波形，通过控制时间门在信号上顺序偏移并记录时间门内信号的幅 度来获取荧光衰减曲线。光子计数技术将探测信号视为单个光子脉冲的随机序列。探测器输出一个脉冲就表示探测到了一个光子。累计光子脉冲在一系列序列时间通道内的个数，即通过脉冲信号的密度而不是幅度来对输入探测器的荧光强度进行时域记录。
时间相关单光子计数（TCSPC）是光子计数技术的最典型代表。TCSPC 技术适用于探测低强度、高重复频率的荧光信号，如生物组织的双光子激发荧光。凭借记录单个光子脉冲在信号周期内出现的时间，并在每个时间点累计有光子脉冲出现的信号周期的个数，就可以建立起光子数随时间分布的直方图，从而得到荧光衰减曲线，进而可以计算荧光寿命。TCSPC 技术能够以极高的时间分辨率和接近理想的效率记录荧光信号，是目前唯一能够可靠地分辨组织自发荧光寿命组分的荧光寿命检测技术。随TCSPC 技术具有的高时间分辨率、高精度、高灵敏度、高效率，以及多维探测的优势使其在生物医学领域得到广泛应用[1-3]。
双光子荧光寿命系统
典型的双光子荧光寿命成像系统如图1所示。当分别采用时域和频域技术进行荧光寿命探测时，系统分别采用飞秒激光和飞秒激光的多次谐波作为样品的激发光源。在系统中，激发光通过一对扫描振镜扫描样本平面实现成像。具体来讲，经过扫描振镜的激发光在通过二向色镜之后，由物镜聚焦到样本上。激发出的双光子激发荧光信号被同一物镜收集；接着，荧光信号经上述二向色镜反射之后与激发光分离，随后进入探测器；最后，探测器将探测到的信号输入荧光寿命探测模块进行处理。就频域探测而言，荧光寿命探测模块测量荧光信号相对于激发光信号的相位和调制度；而在时域探测中，该模块记录荧光信号的衰减曲线。对以上测量结果进行处理和分析后，系统将输出样品具体的荧光寿命信息和荧光寿命图像等。
图 1 典型的双光子荧光寿命成像系统[4]
2016年，Xingde Li组展示了基于全光纤式双光子内窥的荧光寿命显微成像系统。系统原理图如图2所示。将时间相关单分子计数模块整合到双光子内窥系统里，实现荧光寿命的探测。并使用快速频域荧光寿命估计算法，用于对荧光寿命进行实时成像。图3展示了荧光寿命成像结果，DAPI染色的细胞核和Alexa Fluor 488染色的细胞质展示了荧光寿命的差异。
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图 2 全双光子内窥荧光寿命显微成像系统结构图[5] |
图 3 荧光寿命成像图[5] |
参考文献
[1] 李慧,夏先园,陈廷爱,余佳,李曦,郑炜.双光子荧光寿命成像在肿瘤诊断研究中的应用[J].中国激光,2018,45(02):139-152.
[2] Skala M C , Riching K M , Gendron-Fitzpatrick A , et al. In vivo multiphoton microscopy of NADH and FAD redox states, fluorescence lifetimes, and cellular morphology in precancerous epithelia[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007, 104(49):p.19494-19499.
[3] Blacker T , Mann Z , Gale J , et al. Separating NADH and NADPH fluorescence in live cells and tissues using FLIM.[J].Journal of biomedical optics.2013,18(3)
[4] Teh S,et al. Multimodal nonlinear optical microscopy improves the accuracy of early diagnosis of squamous intraepithelial neoplasia[J]. Journal of biomedical optics, 2013, 18(3):036001.
[5] W. Liang, G. Meng, I. Gannot, M. Li, and X. Li, "Real-time Fluorescence Lifetime Imaging by a Fiber-optic Two-photon Endomicroscopy System," in Biomedical Optics 2016, OSA Technical Digest (online) (Optical Society of America, 2016), paper TTu4B.3.
