定义
冷冻电镜就是在传统透射电子显微镜之上，加上了低温传输系统和冷冻防污染系统。冷冻电镜方法结合三维重构技术近年来在结构生物学领域发展迅速，在研究生物大分子结构尤其是超分子体系的结构方面取得了较大的成果。
背景
早在Ernst Ruska (1986年诺贝尔物理学奖得主) 发明电子显微镜后不久Marton便提出，由于电子束对生物细胞与细胞器的轰击，利用这一新设备对生物样品进行研究时，必然会对样品造成损伤。与此同时，为避免空气分子对电子束的散射，电子显微镜工作时需抽成高真空，导致腔内样品中的水分难以保持，丢失大量结构信息。因此，如何减小电子束对生物大分子样品的辐射损伤以获得其尽可能高分辨的结构信息，成为了电子显微镜技术解析生物大分子结构的一大难题。Marton提出构想，利用冷冻或类似负染的样品制备方法，提高样品的抗电子辐射损伤的能力。
然而，利用冷冻电子显微镜研究生物大分子结构时，生物样品的制备和拍摄过程仍面临许多困难。与X射线晶体衍射法相比，单颗粒冷冻电子显微镜技术最为显著的优势在于不需要生物样品结晶。但同时也对样品的制备提出了其他要求，为得到不重叠的单颗粒图像，生物样品必须非常薄，理想情况下只有一个生物大分子层的厚度。在拍摄电镜图像的过程中，由于电子束的作用和热运动的影响，生物大分子通常会发生漂移，尤其是使用摄像模式不做修正地记录图像时，将导致图像模糊，高分辨结构信息丢失。此外，冷冻样品中生物分子与水分子的化学组成元素相似，且成像时必须使用低电子剂量以减小电子辐射损伤，故图像衬度和信噪比通常很低。获得大量生物大分子的二维投影图像后，根据构象和欧拉角取向进行准确分类是单颗粒冷冻电子显微镜技术进行三维结构重建的核心问题。但是，原始单颗粒图像的低信噪比对分类算法提出了严峻的挑战。
工作原理
冷冻电子显微学解析生物大分子及细胞结构的核心是透射电镜成像，其基本过程包括样品制备、透射电镜成像、图像处理及结构解析等几个基本步骤。在透射电镜成像中，电子枪产生的电子在高压电场中被加速至亚光速并在高真空的显微镜内部运动，根据高速运动的电子在磁场中发生偏转的原理，透射电镜中的一系列电磁透镜对电子进行汇聚，并对穿透样品过程中与样品发生相互作用的电子进行聚焦成像以及放大，最后在记录介质上形成样品放大几千倍至几十万倍的图像，利用计算机对这些放大的图像进行处理分析即可获得样品的精细结构。
透射电镜成像过程中，电子束穿透样品，将样品的三维电势密度分布函数沿着电子束的传播方向投影至与传播方向垂直的二维平面上。1968年，AronKlug发现中心截面定理，提出可以通过三维物体不同角度的二维投影在计算机内进行三维重构来解析获得物体的三维结构。根据这一原理，利用透射电镜获得生物样品多个角度的放大电子显微图像，即有可能在计算机里重构出它的三维空间结构。
在冷冻电子显微学结构解析的具体实践中，依据不同生物样品的性质及特点，可以采取不同的显微镜成像及三维重构方法。目前主要使用的几种冷冻电子显微学结构解析方法包括：电子晶体学、单颗粒重构技术、电子断层扫描重构技术等，它们分别针对不同的生物大分子复合体及亚细胞结构进行解析。
（1）电子晶体学
利用电子显微镜对生物大分子在一维、二维以致三维空间形成的高度有序重复排列的结构(晶体)成像或者收集衍射图样，进而解析这些生物大分子的结构，这种方法称为电子晶体学。其适合的样品分子量范围为10~500kD，最高分辨率约0.19nm。该方法与X射线晶体学的类似之处在于均需获得高度均一的生物大分子的周期性排列，不同之处是利用电子显微镜除了可以获得晶体的电子衍射外还可以通过获得晶体的图像来进行结构解析。
（2）单颗粒技术
对分散分布的生物大分子分别成像，基于分子结构同一性的假设，对多个图像进行统计分析，并通过对正、加和平均等图像操作手段提高信噪比，进一步确认二维图像之间的空间投影关系后经过三维重构获得生物大分子的三维结构方法。其适合的样品分子量范围为80~50MD，最高分辨率约0.3nm。利用单颗粒技术获得三维重构的方法主要包括等价线方法、随机圆锥重构法、随机初始模型迭代收敛重构等方法，其基本目标是获得二维图像之间正确的空间投影关系，从而进行三维重构。
（3）电子断层扫描成像技术
通过在显微镜内倾转样品从而收集样品多角度的电子显微图像并对这些电子显微图像根据倾转几何关系进行重构的方法称为电子断层扫描成像技术。该方法主要应用于细胞及亚细胞器，以及没有固定结构的生物大分子复合物(分子量范围为800kD)，最高分辨率约2nm。
冷冻电镜分类
目前我们讨论的冷冻电镜基本上指的都是冷冻透射电镜，但是如果我们以使用冷冻技术的角度定义冷冻电镜的话，冷冻电镜主要可以分为冷冻透射电镜、冷冻扫描电镜、冷冻蚀刻电子显微镜。
（1）冷冻透射电镜
冷冻透射电镜(Cryo-TEM)通常是在普通透射电镜上加装样品冷冻设备，将样品冷却到液氮温度(77K)，用于观测蛋白、生物切片等对温度敏感的样品。通过对样品的冷冻，可以降低电子束对样品的损伤，减小样品的形变，从而得到更加真实的样品形貌。
一台冷冻透射电镜的价格在600万美元左右，价格极其昂贵，它的优点主要体现在以下几个方面：第一是加速电压高，电子能穿透厚样品；第二是透镜多，光学性能好；第三是样品台稳定；第四是全自动，自动换液氮，自动换样品，自动维持清洁。
（2）冷冻扫描电镜
扫描电镜工作者都面临着一个不能回避的事实，就是所有生命科学以及许多材料科学的样品都含有液体成分。很多动植物组织的含水量达到98%，这是扫描电镜工作者最难对付的样品问题。
冷冻扫描电镜(Cryo-SEM)技术是克服样品含水问题的一个快速、可靠和有效的方法。这种技术还被广泛地用于观察一些“困难”样品，如那些对电子束敏感的具有不稳定性的样品。各种高压模式如VP、LVESEM的出现，已允许扫描电镜观察未经冷冻和干燥的样品。但是，冷冻扫描电镜仍然是防止样品丢失水分的最有效方法，它能应用于任何真空状态，包括装于扫描电镜的Peltier台以及向样品室内冲以水汽的装置。冷冻扫描电镜还有一些其他优点，如具有冷冻断裂的能力以及可以通过控制样品升华刻蚀来选择性地去除表面水分(冰)等。
（3）冷冻蚀刻电子显微镜
冷冻蚀刻电镜技术是从50年代开始发展起来的一种将断裂和复型相结合的制备透射电镜样品技术，亦称冷冻断裂或冷冻复型，用于细胞生物学等领域的显微结构研究。
冷冻蚀刻电镜的优点：①样品通过冷冻，可使其微细结构接近于活体状态；②样品经冷冻断裂蚀刻后，能够观察到不同劈裂面的微细结构，进而可研究细胞内的膜性结构及内含物结构；③冷冻蚀刻的样品，经铂、碳喷镀而制备的复型膜，具有很强的立体感且能耐受电子束轰击和长期保存。
冷冻蚀刻电镜的缺点：冷冻也可造成样品的人为损伤;断裂面多产生在样品结构最脆弱的部位，无法有目的地选择。
参考文献
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