倾斜照明

2021-04-20 10:48:23 浏览:1458

定义

倾斜照明(Oblique illumination)是一种从侧面倾斜的角度将光投射到样本以提升图像对比度的技术。

照明原理及结构

倾斜照明系统典型的结构如图1所示:

图 1 倾斜照明系统结构

在聚光镜系统下方是一个不透明的光阑,该光阑并不在中心光轴上并且具有一个小缝隙。来自光源的照明光线穿过狭缝,然后从离轴的单一方位角穿过聚光镜元件系统。倾斜光线从一侧以非常特定的角度照亮标本,并通过靠近光圈边缘(非常靠近镜头座)的前透镜元件进入显微镜物镜。聚焦的光线会聚在物镜的后焦平面处,并导向显微镜的中间像平面,之后通过目镜进行观察。

倾斜的照明光线导致零阶移动到了靠近物镜边缘的某个位置(可以通过聚焦在物镜的后焦平面上的目镜观察到这种效果)。倾斜照明的结果是使穿过样本的光的零阶从中心移到物镜前透镜外侧[1]。零阶从中心到一侧的这种移动使得一个或多个另外的更高阶的衍射光被包括在物镜的后焦平面处,有助于图像的形成。只有零阶的一侧的衍射级(通常称为边带)才被允许进入物镜,并且由于照明的倾斜性,另一侧的衍射级完全错过了物镜。图2中使用光线轨迹和一个简单的透镜来表示显微镜物镜对了这一情况作了解释。

图 2 零阶偏移情况图

通常情况下,当透明样本在透射式明场显微镜中被平行光束照明,所得图像的可见度很差,并且缺乏明显的对比度[2]。原因是被样本上一点衍射的光束和直接透射样本的光束相差四分之一波长的相位差,这两束光会在像平面形成干涉。然而被样本上某一点衍射的光束在零级两侧包含边带,如图2所示。这些边带相交于四分之一波位移有一定的偏移量。如果阻止了衍射光的一个边带到达像平面,则在剩余的边带和直射光之间将发生相长和相消干涉,从而在显微镜的中间像平面上产生可见图像。倾斜照明是一种利于的边带抑制的机制[3]

图2上图展示了明场照明轴向光线穿过样本并进入显微镜的光学系统的路径。衍射光的对称分量进入物镜,并在图像平面上与直接光分量产生无明显干涉的图像(即非相长或相消干涉),从而导致图像的对比度和可见度差。在倾斜照明的情况下,如图2下图所示,一侧的衍射分量边带无法进入物镜,但至少一个高阶分量与零阶进入了物镜,其中D(-2)阶没有出现在后焦平面以增加照明的清晰度,这样在图像平面上的干涉产生具有更好的对比度和可见度的样本图像[4]。图2中还展示了在轴向和倾斜照明时,物镜后焦平面处的衍射的极大值,由于图像形成仅需要两个极大值,因此倾斜照明可以产生图像。

照明特点

倾斜照明相比与传统的明场技术可以分辨更为精细的样品细节,当倾斜的光线以与显微镜光轴成α角入射到物镜,分辨率可以表示为:

 

其中n为聚光镜与物镜之间的介质的折射率为,照明光波长为λ ,NA为数值孔径。如果样品的细节非常精细,以至于零阶和一阶衍射边带之间的距离等于物镜孔径的直径,则分辨力是轴向透射照明的两倍:

 

在许多情况下,利用明场照明解决的标本细节严重缺乏对比度,几乎无法可视化或成像。用倾斜照明观察标本的最终结果通常是分辨率的提高,并且会产生阴影状,浮雕状的样本伪三维图像[5]

倾斜照明技术非常适合成像各种未染色的物体,例如活细胞,晶体,硅藻和类似的透明或半透明标本。但是,由于从一侧衍射的阶次对图像的形成没有贡献,因此必须注意查看和解释生成的图像。图像中可能出现的伪结构可能会严重限制利用倾斜光检测和定量描述先前未观察到的标本细节的可行性。在倾斜照明下观察标本时,应始终考虑到这一事实。

图 3 具有偏心孔径光阑的聚光镜

自显微镜问世以来,倾斜照明所必需的达到条件(已被用来增强样品的可见性)可以通过多种技术和简单的透射光学显微镜来实现。也许最简单的方法是补偿部分关闭的可变光圈或光源。在过去的几年中,一些显微镜配备了一个聚光镜,该聚光镜的孔径可变光圈可偏心。(如图3所示,请注意,聚光镜的透镜系统不应偏离显微镜光轴的中心)该设备经过精心设计,可以使整个光圈在水平面内偏心移动,从而关闭圆形光圈开口将导致零阶移动到物镜后焦平面的外侧。在高级型号中,整个光圈可围绕显微镜的轴旋转,因此倾斜光可以从任何方位角朝向标本,从而为给定样本实现最佳预期效果。

与传统的明场技术相比,倾斜照明可以显着提高标本对比度[6],如图4所示的数字图像所示。图4(a)中的标本是一个牛动脉细胞,通过调节聚光镜孔径在明场照明下成像以获得最大的对比度。很明显,标本几乎是不可见的,在明场照明下很难区分细节。相反,当使用聚光镜孔径附近的扇形光阑倾斜照亮标本时(图4(b)),对比度显着提高,许多细胞细节(包括核和假足的位置)变得可见。无论显微技术人员采用哪种对比增强技术(包括相位对比,微分干涉对比,暗场或霍夫曼调制对比),该特定样本都很难成像。在图4(c)和4(d)中显示的老鼠肾脏较厚的切片更易于成像。在明场照明下(图4(c)),一些标本的细节可见,但特定特征难以区分,整个图像严重缺乏对比度。如图4(d)所示,利用扇形光阑倾斜地照亮标本可以显着改善对比度。在此数字图像中,可以看到以前很难在明场照明下观察到的微小样本细节。

图 4 倾斜照明和明场照明对比

当在几个方向角上倾斜照明观察半透明的山羊毛标本时,可获得相似但不太生动的结果。当杆状毛发的长轴平行于入射倾斜照明定向时(图5(a)),可以看到头发纤维的中央部分和边缘的结构细节。当毛发纤维垂直于照明轴定向时(图5(b)),此细节不存在,并且在两个定向角度之间观察到纤维的表观厚度存在显着差异。平行于入射照明定向的纤维似乎比垂直于光源定向的纤维粗得多。因此,很明显不能可靠地采用倾斜照明技术从通过该方法收集的图像中准确的测量数据。

图 5 照明角度对倾斜照明的影响

参考文献

[1] Ying Ma,Siyue Guo,Yang Pan,Rong Fan,Zachary J. Smith,Stephen Lane,Kaiqin Chu. Quantitative phase microscopy with enhanced contrast and improved resolution through ultra‐oblique illumination (UO‐QPM)[J]. Journal of Biophotonics,2019,12(10).
[2] 工程光学 [M]. 机械工业出版社,郁道银,谈恒英, 2017
[3] Xiao Ma,Bowen Zhou,Zijian Su,Zibang Zhang,Junzheng Peng,Jingang Zhong. Label-free 3D imaging of weakly absorbing samples using spatially-incoherent annular illumination microscopy[J]. Ultramicroscopy,2019,200.
[4] 马英. 超斜照明量化位相显微镜研究与应用[D].中国科学技术大学,2019.
[5] Carlos Sanchez,Gabriel Cristóbal,Gloria Bueno,Saul Blanco,Maria Borrego-Ramos,Adriana Olenici,Anibal Pedraza,Jesus Ruiz-Santaquiteria. Oblique illumination in microscopy: A quantitative evaluation[J]. Micron,2018,105.
[6] Jesús Ruíz-Santaquiteria,José Luis Espinosa-Aranda,Oscar Deniz,Carlos Sanchez,Maria Borrego-Ramos,Saúl Blanco,Gabriel Cristobal,Gloria Bueno. Low-cost oblique illumination: an image quality assessment[J]. International Society for Optics and Photonics,2018,23(1).

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