相位对比显微镜(Phase Contrast Microscope, PCM)

2021-04-20 13:24:16 浏览:2505

定义

利用光的衍射和干涉现象,把相位差变为振幅差来观察活细胞和未染色标本的显微镜。

背景

当在明场照明下的光学显微镜中观察时,大量的活生物标本几乎是透明的。为了提高此类样品的可见度和对比度,显微镜专家通常会减少次聚光镜虹膜光阑的开口尺寸,但是这种操作会严重降低分辨率,并引入衍射伪像。

1935年,荷兰物理学家塞尔尼克发现相衬法原理,并制成一种特殊装置(环状光阑和相板),这些装置可使相位差转变为光强差,使相位物体产生可见的影像。1936年,蔡司厂生产出第一台相位对比显微镜。1947年,奥斯特伯克成功设计出变偏振光相位对比显微镜也即变色相位对比显微镜。

工作原理

活细胞和未染色的生物标本,由于其各部细微结构的折射率和厚度的不同,当光波通过时,波长和振幅并不发生变化,仅相位发生变化。通常情况下,与未受影响的直通光线相比,会产生大约1/4波长的相位延迟。我们的眼睛和胶卷无法检测到这些相位差。塞尔尼克成功地设计出了相位对比显微镜,用于使未染色的样本产生对比度图像。当衍射光和直射光产生1/2波长的相位差时,样本会显示出出色的对比度。塞尔尼克的方法是将直通光产生1/4波长的相位超前,以使样本的直射光和衍射光之间的相位差为1/2波长。因此,到达目镜的直通光和衍射光便能够产生相消干涉。这样的过程导致图像的细节在较亮的背景下显得更暗,称为暗相位对比或正相位对比。相位对比显微镜就是通过改变这种相位差,并利用光的衍射和干涉现象,把相差变为振幅差来观察活细胞和未染色的标本。

结构

典型的相位对比显微镜结构如下图1所示。相差显微镜和普通显微镜的区别主要有:用位于光源与聚光器之间的环状光阑代替可变光阑,使透过聚光器的光线形成空心光锥,焦聚到标本上;用带相板的物镜代替普通物镜,可将直通光的相位提前或延迟1/4波长;带有一个合轴用的望远镜,用于调节环状光阑的像与相板共轭面完全吻合。

 

图 1 典型的相位对比显微镜结构

优缺点

相比于其他光学显微镜,相差显微镜的优势在于可以观察到透明样品的清晰图像,可见到细胞核的形态,甚至可观察到细胞浆中的颗粒。这项技术为改善未染色生物标本的对比度提供了一种很好的方法。

与此同时,相位对比显微镜也存在一定的局限性。由于相位图像通常被环绕在细节轮廓周围的光环所包围,有时会模糊比较细节的边界。此外,相位环在一定程度上限制了光学系统的工作数值孔径,从而降低了分辨率。

应用

广泛用于检测未经染色的标本和活细胞,例如培养中的细胞和组织,特别适用于薄且会分散在视野中的样品。此外,该技术目前还常与荧光技术同时使用,以看清样本不发荧光的区域。

参考文献

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