单光子荧光效应

2020-12-21 15:14:14 浏览:1340

定义

使用激励光照射物体,激励光光子与物体分子相互作用产生电磁波的过程称为荧光效应。物体分子与单个激励光光子相互作用产生电磁波的过程称为单光子荧光效应。

背景

能发生荧光效应的物质称为荧光体(Fluorophores)或者荧光染料(Flourescent Dyes)。科研人员使用荧光体作为荧光体探针对特定生物组织进行成像,以便于研究活性细胞特性。其中荧光体探针指在生物组织内特定位置对特定波长激励光相应的荧光体。

原理

如图1所示,荧光体或荧光染料中激励光光子与荧光物质分子发生的单光子效应一般分为三个阶段。下面结合荧光体分子核外电子单光子荧光效应能级示意图介绍单光子荧光过程。

图 1 荧光体分子核外电子单光子荧光效应能级示意图

如图1所示,单光子荧光效应第一过程称为激励过程(Excitation)。一般选用激光器或者白炽灯作为光源,光源发出的激励光中包含能量为hvex的激励光子。荧光体分子核外电子高能级对应的能量S’1与激励光光子能量hvex相等。一部分能量为hvex的激励光子与荧光物质分子中处于基态能级S0的核外电子相互作用,处于基态的核外电子会吸收激励光子的能量,跃迁到对应能量的高能级上。荧光体分子核外电子在吸收对应波长激励光子能量后跃迁至高能级,将荧光体核外电子高能级称为激励态(Excite-State),对应图中S’1。

单光子荧光效应的第二过程称为非辐射跃迁。荧光体分子核外电子一般只会在激励态S’1停留有限的时间(1~10纳秒)。在这个时间内,内荧光体需要完成相应的构象变化(Conformational Change),完成构象变化的处于激励态的荧光体分子核外电子会经历两种不同的结果。第一种结果是处于激励态的荧光体分子核外电子,在完成构象变化后首先非辐射跃迁至亚稳态能级S1,这个过程中会有能量损失但是不会向外辐射电磁波。处于亚稳态能级S1的荧光体分子核外电子会在后续辐射跃迁过程中产生用于荧光成像的荧光光子。第二种结果是,处于激励态的荧光体分子核外电子完成构象变化后会发生碰撞湮灭(Collisional Quenching),损失能量的同时不会产生荧光光子。因此碰撞湮灭的存在会降低荧光光子产生效率,不利于荧光成像。由于处于激励态荧光体分子核外电子碰撞湮灭现象的存在,使得处于激励态的核外电子数大于产生荧光光子的核外电子数。在此将最终通过辐射跃迁产生荧光光子的核外电子数与处于激励态的荧光体分子核外电子数的比值称为荧光量子产率(Quantum Field),荧光量子产量越高,同等激励光强度照射下产生的荧光光子数量越高,有利于荧光成像。

图 2 斯托克斯位移示意图

单光子荧光效应的第三过程称为辐射跃迁过程,处于亚稳态能级S1的荧光体分子核外电子最终会以辐射跃迁的方式跃迁至基态S0,并在跃迁过程中向外辐射与能级差相等能量的光子(电磁波),这个光子即为单光子荧光效应产生的荧光信号。如图 1所示,荧光光子能量为hvEM,其值与位于亚稳态能级S1相等。由于亚稳态能级S1与激励态存S’1在一个能极差,因此亚稳态能级跃迁至基态产生荧光光子的能量hvEM比激励光光子能量hvex低,对应荧光光子比激励光光子波长长。将激励光光子与信号光光子的波长或者能量差称为斯托克斯位移(Stokes Shift)。斯托克斯位移的存在提高了荧光信号探测的信噪比,因为信号光与激励光波长存在差异,因此通过相应的光学系统滤光,可以分离荧光信号光与激励光,提高系统的信噪比,使得图像成像质量更优。这也是荧光成像的一个优点。

应用

单光子荧光效应在生物成像领域的有较多应用,从应用较广的宽场荧光显微镜,到后来的具有层析能力的共聚焦激光扫描显微镜,都以单光子荧光效应作为理论基础。

参考文献

[1] Albani, J.R., Principles and Applications of Fluorescence Spectroscopy, Wiley-Blackwell (2007).
[2] https://www.thermofisher.com/cn/zh/home/references/molecular-probes-the-handbook/introduction-to-fluorescence-techniques.html
[3] https://www.scientifica.uk.com/learning-zone/widefield-fluorescence-microscopy
[4] Park J S , Bae S H , Jun T H , et al. In vivo cell tracking using speckle image correlation technique employing high frame rate confocal laser scanning microscopy in a mouse skin model[J]. Journal of Mechanical Science and Technology, 2019, 33(6).

荧光成像

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