定义
利用多光子吸收效应，激发生物组织荧光的成像光学成像手段。
背景
1931年，德裔物理学家Maria Goppert-Mayer在理论上推导了两个光子在一个基本过程中的相互作用，将其称为双光子同时激发[1]。1961年，德国科学家W.Kaiser使用红宝石激光器694.3nm的红光，照射晶体，观测到425nm的蓝色荧光。首次通过实验观测到双光子激发现象的产生[2]。1990年美国康奈尔大学Denk等人将双光子激发现象应用到共聚焦扫描显微镜中，开辟了双光子荧光显微成像的新领域[3]。
双光子激发原理
对于双光子显微荧光成像，介质分子同时吸收两个能量较小，波长较长的光子，并跃迁至激发态，随后由激发态弛豫一段时间，重新回到基态。在此过程中，辐射出一个波长较短，能量较高的荧光光子。双光子激发原理图如图1所示。
工作原理
使用激光器发射出一束激光作为光源，输出的激光通过一个物镜聚焦在样品表面。通过改变激光束聚焦在样品的位置，实现激光聚焦点在样品一片区域内的扫描。产生的荧光信号被光电探测器收集。采集激光束扫描至每一点时产生的荧光信号，经过图像重构得到该片样本区域的荧光成像。
双光子显微镜是将双光子激发现象应用到共聚焦扫描显微镜中演变而来，由于双光子激发属于非线性效应，相对于整个光路上都产生荧光的单光子激发，双光子激发很少产生焦平面以外的杂散光，具备层切能力。因此取消了针孔结构。
但是在光源方面，共聚焦显微镜使用经过聚焦后的激光照射样本。光源激光器输出激励光经过衰光片（Neutral Density Filter）经行光强调节。
经过强度调节后的激励光进入一个由两个可快速精密调节角度反射镜组成的XY反射镜组。两个反射镜分别对应X轴Y轴方向，通过调节两个反射角度，使得经过XY反射镜组的出射激励光在一定面积的平面范围内按一定轨迹进行扫描。常见的扫描轨迹有栅格形（Raster）扫描轨迹、螺旋形（Spiral）扫描轨迹。
XY反射镜组输出的扫描激励光传输到物镜的后方焦平面（Back Focal Plane），经过物镜（Objective）后的激励光会以焦点的形式随着XY反射镜组的工作在样本处进行扫描。扫描过程中的入射激励光会与生物组织样本中的荧光物质相互作用产生荧光，一部分荧光会沿与入射激励光相反的方向在先后通过物镜和XY反射镜组后进入分光镜（Beam Spilter）中，分光镜会反射激励光，同时不会反射信号光，起到分离激励光与荧光的作用。
荧光信号具有较强的层析能力，同时由于光强较弱，需要使用灵敏度较高的光电探测器进行探测。在此一般使用光电倍增管（Photomultiplier Tube，PMT）将荧光信号放大并转换为电信号，此电信号为模拟信号。光电倍增管可以在不引入噪声的情况下将微弱的光信号放大约一百万倍。光电探测器输出的电信号强度与输入荧光强度成正比。经光电倍增管转换成，与荧光强度成正比的电信号随后由模数转换器转换为数字信号，此数字信号对应样本焦点处荧光信号强度。随XY反射镜组扫描，通过探测特定深度一定样本区域内的荧光信号，得到每一点荧光强度对应的数字信号值，经过计算机图像处理将每一个数字信号值转换为对应的灰度值，每一灰度信号值对应一个像素点，将每个灰度信号与激励光扫描轨迹相对应得到成像图。
双光子荧光显微镜组成部分：
（1）飞秒激光器（Laser）：根据样本中荧光体最敏感的波长，选择对应波长的飞秒激光器作为激励光光源。
（2）分光镜（Beam Splitteer）：分光镜为一个滤光片（Filter），用于将荧光中掺杂的激励光分离出来，以便于荧光的后续处理。
（3）XY扫描镜组（Scanner）：这是一个由两个或多个反射镜组成的镜组，用于引导聚焦后激励光焦点在样本上进行点对点（Pixel-by-pixel）和行对行（Line-to-line）的扫描。
（4）物镜组：共聚焦显微镜的核心器件之一，用来调节成像系统的分辨率。
（5）光电倍增管（Photomultiplier tube，PMT）：高度灵敏的光电探测器，将微弱光信号转换为电信号，方便后续的信号采集与数据处理。
双光子显微镜结构图如图1所示。关键器件包括提供飞秒脉冲激光的飞秒脉冲激光器，用于进行x,y方向扫描的扫描振镜，用于对入射光和激发荧光进行分光的二向色镜，及对荧光信号进行收集的光电倍增管等。PMT接收到的随时间变化的荧光信号被映射到相 应的像素(pixel)，即可实现样品线扫描、面扫描和体成像。由于PMT收集到的荧光一定来自焦点位置，因此并不需要类似共聚焦点扫描成像时的PMT前置 的荧光收集针孔，可以更加有效地收集来自散射组织深层产生的信号。
图 1 双光子激发能级图[5]
图 2 双光子显微镜结构原理图[5]
优缺点
相比于单光子的共聚焦显微成像技术，多光子荧光显微成像具有以下优点[4-5]：
1、由于使用红外波段的激发光波长，生物组织样本散射系数小，组织穿透性更好。可用于深层组织成像[6-10]。
2、由于多光子激发属于非线性效应，对激发光子的光子密度要求高。因此只有激发光焦点附近处的荧光分子会产生荧光，可有效减少样本的光毒性和光漂白程度。
3、由于是扫描式成像，具备光切片能力和三维重构能力，成像分辨率高。
4、双光子荧光成像可展现丰富的生化信息。如可观测表征细胞代谢水平高低的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和氧化黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD），细胞代谢水平高低的高低与癌细胞诊断筛查密切相关[11-12]。此外，二次谐波信号（SHG）细胞的胶原纤维成分[13]可通过单一波长激发而同时获得。
缺点：系统成本昂贵，且由于点扫描成像，成像速度受限于扫描振镜的扫描速度。
应用
双光子显微镜自1990年诞生以来已，凭借可实现无标记，高分辨，生化信息功能的实时成像，多光子荧光成像被广泛应用于肿瘤检测[14]，皮肤检测[15-16]，动物脑部神经元观测研究[17-18]及新陈代谢检测[19]。
示例：如图3所示，对小鼠肾缺血再灌注模型进行成像，首先夹紧麻醉小鼠的左肾动脉和静脉导致其肾脏缺血 （４min）后，再进行再血液灌注。NADH和FAD为细胞的内源性荧光物质，氧化还原率的表示为FAD/（NADH+FAD）。缺血时 NADH浓度增加，氧化还原比随之下降，供氧时反之。图3上中下三层分别表示NADH，FAD，氧化还原比的强度大小，从左到右表示缺血前，缺血中，再供血三种状态。可见在肾脏处于缺血状态时，氧化还原比明显减小，出现红色区域，如图3（h）所示。再供血之后，氧化还原比恢复，红色区域消失，如图3（i）所示。该系统展示了该双光子内窥显微成像系统对细胞内源性荧光物质的优异的成像能力。
图 3 肾缺血再灌注模型双光子内窥成像
参考文献
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