光片荧光显微镜(Light Sheet Fluoresnence Mircoscopy)

2020-12-28 10:06:03 浏览:1243

定义

光片荧光显微镜一种具有较好层析能力的,具有较高光学分辨率的快速荧光显微镜。

概述

宽场荧光显微镜仅会对与荧光信号收集光路相垂直的一个平面区域内的生物组织样本进行激励光照射,即使用一个片状激励对样本进行照射,通常这个光片厚度为几百纳米到几微米。使用可以产生片状激光束的激光器作为光源。片状激光束生成方法为,使用圆柱型透镜对激光束进行单方向聚焦,也可使用圆柱形激光束进行横向一维扫描得到片状激励光覆盖区域。

背景

传统宽场荧光显微镜(Wide Field Fluorescence Mircoscopy)会对光束范围内的所有样本进行荧光激励,并通过接收荧光信号进行成像。荧光信号包括来自焦平面(Focal Plane)和离焦区域(Out-of-focus Area)荧光体产生的背景荧光信号,因此成像层析能力较差,无法进行三维成像。使用激励光对样本进行照射时,可以通过提高激励光光强从而增加荧光信号生成量,但是会增加对生物组织样本的光毒性,严重时甚至会损坏生物组织样本。综上,宽场荧光显微镜不仅成像质量差,而且无法对生物组织样本进行三维成像。

共聚焦荧光显微镜(Confocal Fluorescence Mircoscopy)通过加入小孔(Pinhole)除去离焦荧光信号,使得所收集到的荧光信号均来自样本焦平面处。因此通过小孔的引入,可以降低离焦噪声信号,提高成像信噪比。小孔的引入使得共聚焦显微镜具有一定深度分辨率,通过获得每一层的样本成像,以及后续的图像数据处理,可以得到三维立体成像。但是在共聚焦显微镜中,仅在收集荧光信号过程中通过小孔保留焦平面处荧光信号,在使用激励光照射样本时,包含焦平面和离焦区域内的样本都会受到照射,受到激励光光漂白和光毒性的不良影响,不利于对活体生物组织长期成像。

因此可长时用于活体生物组织成像的3D荧光成像技术应具备以下特点:

1、对生物组织样本尽可能小的光漂白和光毒特性,以延长成像持续时间。

2、可以在长时间内进行3D动态成像。

3、无需使用载玻片或盖玻片固定,即可对体积较大的活体生物组织样本进行3D成像。

4、可以简便地对生物组织样品进行断层成像。

5、避免产生离焦荧光信号,以提高信噪比。

6、2004年首次实现的光片显微镜(Light Sheet Mircoscopy)可以满足上述成像需求,光片显微镜也被称为单平面照射显微镜(Single Plane Illumination Mircoscopy,SPIM),其工作原理最早在1903年便被提出[1]

从光照范围上对比,宽场荧光显微镜、共聚焦荧光显微镜和光片显微镜具有如下区别:

1、宽场荧光显微镜,会对包括焦平面和离焦平面在内一片区域进行萤光照射和信号光收集成像。

2、共聚焦荧光显微镜,聚焦后的激励光照射范围较小,光通道内所有生物组织均会产生荧光信号,但是通过小孔滤波,仅收集光束中焦点位置的荧光信号用于成像。同时需要点扫描以覆盖一片生物组织样本区域。

3、光片显微镜中,激励光入射方向,与荧光信号收集通道相互垂直。

工作原理

如图1所示[1],在光片显微镜中,激励光束光路与信号光收集光路相互垂直。激励光通过光束变换,对一维光束进行汇聚,转换为扁平状。并通过此扁平状光束照射样本,并使收集光路焦平面与扁平状激励光束光腰部分所照射到的样本区域相重合。由于照射到样本上光腰部分的激励光在收集光路方向上仍具有一定厚度,所以仍会有少量的离焦噪声荧光信号产生。

图 1 光片显微镜光路示意图

如图2所示[2],通过穿过一个圆柱形的透镜,仅对激励光的一个维度进行汇聚,通过圆柱形透镜的激励光被整形成为类似沙漏状。使用沙漏的中心部分,即通过圆柱形透镜后激励光的光腰部分照射样本,这样可以使一个平面的样本被照射到。被照射到的样本所产生的荧光信号,通过一个物镜进行收集,并转导至光电探测器处进行成像。

图 2 光片显微镜系统结构图

特点

这样的成像系统设计具有如下优点:

1、使用激励光进行照射时,仅有一个层面的样本受到照射产生荧光信号,离焦区域产生的噪声荧光信号较小,信噪比高。

2、在很多光片显微镜中,光学器件保持静止不动,通过改变样本的姿态和位置进行成像区域的调节。移动样本使得光片扫描一片更大的样本区域,再通过后期的图像拼接可以得到一个比视场更大的样本成像。通过旋转样本,可以对各个不同角度的样本进行成像,也可将同一轴向不同角度样本成像进行结合,得到样本的3D立体成像。

3、由于光片显微镜可以直接对具有一定面积区域的样本进行成像,因此相较于点扫描成像的共聚焦显微镜,光片显微镜具有更高的成像速度。

4、光片显微镜中,因为仅有所需观察区域被激励激光束照射,所以这种方法可以降低激励激光束对样本的光毒性。

5、片状的激励光可以时光片荧光显微镜具有较高的层析能力,离焦区域的样本几乎不会产生背景荧光噪声信号,因此具有较高的信噪比。

6、因为光片荧光显微镜使用片状激励光照射样本,而不像共聚焦显微镜使用激励光焦点对样本进行点对点扫描照射,所以光片荧光显微镜具有相对较高的成像速度,通常为点扫描成像方法的100到1000倍,可以捕捉一些样本的动态过程。

应用

如图3所示,为使用光片显微镜对5周大小鼠脑部成像示意图,图中C部分为脑皮质中的神经元,H部分为鼠脑中的海马体[3]

图 3 光片显微镜小鼠脑部成像图

活体生物组织样本,特别是处于成长过程中的胚胎,这些生物组织对光照较为敏感。因此可以使用光片显微镜观察这些对光照敏感的生物组织样本。通过对样本某一平面区域进行照射,并从与照射平面相垂直的方向收集荧光信号,得到这一片照射区域的成像。由于对于生物组织离焦范围内激励光照射较少,因此仅有焦平面处的样本受到激励光光毒作用的负面影响。光片显微镜在本质上具有层析能力。通过将样本穿过激励光片,通过数据处理可以对穿过激励光片的样本进行3D立体成像。

参考文献

[1] https://www.leica-microsystems.com/science-lab/confocal-and-digital-light-sheet-imaging/
[2] Santi, P. A. Light Sheet Fluorescence Microscopy: A Review[J]. Journal of Histochemistry & Cytochemistry Official Journal of the Histochemistry Society, 59(2):129-138.
[3] Huisken, J. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy[J]. Science, 2004, 305(5686):1007-1009.

荧光成像

作          者: 泮桥成像光电商城

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