结构光照明荧光显微技术(SIM)

2020-12-28 10:34:03 浏览:2065

背景

2000年,Mats Gustafsson博士提出使用结构光照明来提高显微镜分辨率的概念[1],并于 2008年优化出成像效果较好的三维结构光显微镜[2],用于生物样本超光学衍射极限分辨率观察。

工作原理

SIM技术是另外一种基于点扩展函数(PSF)调制的超分辨显微成像技术,也同属于宽场成像的一种。在光学傅里叶域,显微镜的作用就是一个低通滤波器,将图像的高频信息滤除,导致成像分辨率的降低,并使成像分辨率受限于光学传递函数的大小。常规的显微镜通常使用均与照明,以此来定量化生物组织的荧光强度。但在结构光照明荧光显微技术中,照明光路中引入空间光调制器,光栅,数字微镜阵列DMD等结构光调制器,将不同的光照模式投射到样本表面并在空间频域上对其进行调制。实现将光学传递函数范围以外的高频信息平移到光学传递函数范围内,并通过后期的算法还原出代表图像细节的高频分量。对于线性结构光超高分辨率显微镜而言,可将光学传递函数截止频率两倍以内的高频信号平移至光学传递函数的截止频率以内,实现超光学衍射极限两倍的分辨率指标提升。使用结构光照明荧光进行显微成像图解步骤如图1所示。图2为在常规显微镜中,样本的共轭平面放置光栅,进行结构光调制以实现超光学衍射极限分辨率成像。

图 1 使用结构光照明荧光进行显微成像图解步骤[3]

图 2 结构光显微成像基本原理图[3]

分类

通过改变宽场荧光显微镜照明光的结构就可以得到结构光照明荧光显微镜,因此,结构光的发生装置是这类显微镜的关键,其余成像部分跟普通的荧光显微镜类似。根据结构光发生装置的区别,SIM可分为光栅型,空间光调制器型,DMD型。

优缺点

分辨率:横向分辨率为100~130nm,轴向分辨率约为300nm,时间分辨率可达毫秒量级;

优点:相比与PALM/STORM等方法需要特定的光开关探针、STED需要极其光稳定的探针,结构光超高分辨率显微镜与常用的荧光探针兼容;

缺点:图像重构存在运动伪影[4-6]

应用

SIM的主要应用领域涉及光学切片、超分辨率成像、表面轮廓成像,以及相位成像四个方面[7]

1、光学切片

由于生物样品通常较厚,使用普通的光学显微手段难以获得其清晰的全貌,因此发展出了使用光学切片成像重构三维样品全貌的技术手段。SIM采用的光学和计算技术的组合方法,可实现具有如宽视场成像以及更低的光毒性等优点的光学切片。

2、超分辨率成像

利用SIM,科学家可以观察到常规荧光显微镜无法分辨的细节信息。通过使用3D-SIM观察细胞,可以获得细胞器结构等亚细胞结构的超分辨率图像。为了进一步提高分辨率,可使用非线性SIM。已有报道将只需要较低能量就能产生非线性效应的可逆光开关荧光蛋白运用于非线性结构光照明荧光显微镜,并用它观察哺乳动物的核膜孔和肌动蛋白细胞骨架,分辨率达到60 nm[8]。图为超分辨结构光显微镜用于观察用于观测细胞器,如线粒体成像。

图 3 超分辨结构光显微镜用于线粒体成像[6]

3、表面轮廓成像

利用3D-SIM,通常采用正弦条纹结构光照射样品后,通过投影采集、边缘分析、相位展开与校准等步骤,亦可获得较高分辨率的表面图像。

4、相位成像

使用SIM采集相位物体的图像之后,通过相位重构以及相位扩展,亦可获得具有较高分辨率的相位图像。

参考文献

[1] Gustafsson M G L . Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. SHORT COMMUNICATION[J]. Journal of Microscopy, 2000, 198(Pt 2):82-87.
[2] Gustafsson M G L , Shao L , Carlton P M , et al. Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination[J]. Biophysical Journal, 2008, 94(12):4957-4970.
[3] Manish Saxena, Gangadhar Eluru, and Sai Siva Gorthi, "Structured illumination microscopy," Adv. Opt. Photon. 7, 241-275 (2015)
[4] 付芸,王天乐,赵森.超分辨光学显微的成像原理及应用进展[J].激光与光电子学进展,2019,56(24):21-33.
[5] 吕志坚,陆敬泽,吴雅琼,陈良怡.几种超分辨率荧光显微技术的原理和近期进展[J].生物化学与生物物理进展,2009,36(12):1626-1634.
[6] 黄小帅,李柳菊,范俊超,刘彦梅,谭山,陈良怡.活细胞超灵敏结构光超高分辨率显微镜[J].中国科学基金,2018,32(04):367-375.
[7] Gustafsson M . Nonlinear structured-illumination microscopy: Wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005, 102(37):p. 13081-13086.
[8] Rego E H , Shao L , Macklin J J , et al. Nonlinear structured-illumination microscopy with a photoswitchable protein reveals cellular structures at 50-nm resolution[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2011, 109(3):E135-43.
[9] https://baike.baidu.com/item/结构光照明荧光显微技术/20864395

荧光成像

作          者: 泮桥成像光电商城

出          处: https://www.ipanqiao.com/entry/74

版          权:本文版权归泮桥成像光电商城所有

免责声明:本文中使用的部分文字内容与图片来自于网络,如有侵权,请联系作者进行删除。

转          载:欢迎转载,但必须保留上述声明;必须在文章中给出原文链接;否则必究法律责任。

Copyright © 2019-2022 南京超维景生物科技有限公司 版权所有 www.ipanqiao.com苏ICP备20009590号-1
联系我们
立即做合同
微信客服
电话咨询

400-998-9826

17302548620

快速留言

泮桥成像光电商城专业人员会在24小时之内联系您

关闭 提交