拉曼散射显微成像(CARS/SRS)

2020-12-28 10:58:29 浏览:1988

背景

相干拉曼散射显微技术是一种基于拉曼散射的光学显微成像方法, 主要包括相干反斯托克斯拉曼散射(Coherent Anti-Stokes Raman Scattering, CARS)和受激拉曼散射(Stimulated Raman Scattering, SRS)。

1966年,美国福特公司的研究科学家发现CARS现象[1]。1982年,CARS成像被首次运用到显微成像[2]。1999年,太平洋西北国家实验室X.Sunney Xie使用共线系统结构,实现三维振动成像。促进了CARS成像的发展过程[3]

1962 年,E. J. Woodbury和W. K. Ng首先实验观测到受激拉曼散射SRS现象[5]。虽然SRS现象发现早于CARS成像,但是SRS成像在近二十年才获得长足发展。2008年,太平洋西北国家实验室X.Sunney Xie展示高灵敏度无标记受激拉曼散射显微成像,用于观察药物传输过程[6]

拉曼散射显微成像原理

CARS能级如图1(a)所示,通常使用斯托克斯Stokes光和泵浦pump光两束光来激发样本,斯托克斯Stokes光频率为ωs,泵浦光频率为ωp,介质化学键振动频率为Ω,如果三者满足共振频率ωp-ωs=Ω时,将会激发产生频率为ωas=2ωp-ωs 的反斯托克斯光。

SRS能级图如图1(b)所示,当斯托克斯Stokes光和泵浦pump光两束光激发样本时,光子与生物组织分子之间发生能量转移,泵浦光光子部分能量转移到分子的振动能级,泵浦光束强度损失(Stimulated Raman Loss, SRL),称为受激拉曼损失。斯托克斯光强度升高,称为受激拉曼增益益(Stimulated Raman Gain, SRG)。SRL 和 SRG均可提供受激拉曼散射成像的对比度差异。

图 1(a)CARS能级图(b)SRS能级图[4]

组成部分

CARS显微结构图如图2所示。皮秒脉冲激光器,输出波长为1064 nm和532 nm ,分别为基频光和倍频光,基频光为斯托克斯光,倍频光为泵浦光。通过延时线用于调节两束光的空间完全重合。外置同步器使两脉冲时序上同步。相比 CARS, SRS 主要在斯托克斯光路上增加了信号调制器以及锁相放大器,其余结构类似。 SRS显微成像结构图如图3所示。

图 2 CARS显微结构图[6]   

 图 3 SRS显微成像结构图[8]

优缺点

优势:无标记高特异性成像,可对活体细胞的脂质颗粒、胶原蛋白、小分子药物颗粒进行成像,具备体成像能力。

缺点:系统激光器成本高,相干反斯托克斯拉曼散射CARS易受非共振背景噪声影响,受激拉曼散射SRS光源稳定性有待提高[4,6]

应用

CARS应用

(1)CARS 显微镜对脂肪储存的无标记成像依赖于 C-H 的固有分子振动,同时使 用 CARS 和双光子激发荧光(Two-photon excited fluorescence,TPEF)成像可以实现中性脂滴和自发荧光肠道颗粒的无标记可视化,用于分析脂质储存的遗传变异和代谢途径之间的关系[4]

图 4 CARS与双光子荧光信号用于脂滴成像[9]

SRS应用

(1)用于对脂类分子定量地观察其空间分布。为了更好地了解肥胖及其相关代谢问题,需要深入分析脂肪在细胞水平和组织水平积累的调控机制。SRS显微术使追踪脂类分子的动态活动成为可能,为解释与脂质相关的生理现象与机制提供了新的方法。

(2)SRS用于准确地运输过程及定位,进而分析药物分子对特定生理功能的实现作用。 例如下图所示,使用SRS 显微镜观察了组织中无标记的药物输运情况。二甲亚砜(DMSO)和维甲酸(RA)两种物质在小鼠皮肤组织中的转运过程图像。二甲亚砜和维甲酸亲水性不同, 通过角质层的方式也不同。 SRS 图像显示了这两者在输运方式上的差别和在角质层中的分布, 具有很强的药代动力学探测能力[8]

图 5 二甲亚砜(DMSO) 左 维和甲酸(RA) 右 的SRS成像结果[8]

参考文献

[1] Terhune R W , Maker P D , Savage C M . Measurements of Nonlinear Light Scattering[J]. Physical Review Letters, 1965, 14(17):681-684.
[2] Duncan M D, Reintjes J F, Manuccia T J. Scanning coherent anti-Stokes Raman microscope[J]. Optics Letters, 1982, 7(8):350-352.
[3] Zumbusch A , Holtom G R , Xie X S . Three-Dimensional Vibrational Imaging by Coherent Anti-Stokes Raman Scattering[J]. Physical Review Letters, 1999, 82(20):4142-4145.
[4] 李姿霖,李少伟,张思鹭,沈炳林,屈军乐,刘丽炜.相干拉曼散射显微技术及其在生物医学领域的应用[J/OL].中国激光:1-18[2020-02-17].
[5] Cheng J X , Xie X S . Coherent Anti-Stokes Raman Scattering Microscopy:? Instrumentation, Theory, and Applications[J]. The Journal of Physical Chemistry B, 2004, 108(3):827-840.
[6] 陈涛,虞之龙,张先念,谢晓亮,黄岩谊.相干拉曼散射显微术[J].中国科学:化学,2012,42(01):1-16.
[7] Woodbury EJ, Ng WK. Ruby laser operation in the Near IR. Proc of the IRE.1962,50:2367
[8] Freudiger C W, Min W, Saar B G, et al. Label-Free Biomedical Imaging with High Sensitivity by Stimulated Raman Scattering Microscopy[J]. Science,2008,1857-1861.
[9] Yen K , Le T T , Bansal A , et al. A Comparative Study of Fat Storage Quantitation in Nematode Caenorhabditis elegans Using Label and Label-Free Methods[J]. PLOS ONE, 2010, 5.

荧光成像

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