定义
结构光显微成像(SIM)是一种用带有一定结构的激发光照明样本,利用莫尔条纹效应获取样本高频信息以实现超分辨率的荧光显微成像技术。
结构光的产生
在结构光照明显微镜中,一般通过两束或三束平面波发生干涉来产生结构光。其中两束光干涉用于二维结构光照明显微成像,三束平面波干涉用于三维结构光照明显微成像。
有多种不同器件可以用于产生结构光,如SLM(空间光调制器,Spatial Light Modulator)、DMD(数字微反射镜,Digital Micromirror Device)、衍射光栅等。其中SLM具有刷新频率高、可编程等优点,应用SLM的结构光照明显微镜具有较高的成像速率。
在结构光照明显微镜中,结构光光强一般为正弦分布,数学形式如下:
其中m表征了结构光干涉条纹的对比度。
结构光成像基本原理
在普通的荧光显微镜中,会使照明光强度的空间分布尽量均匀。在结构光照明显微镜中,照明光变成了具有特定空间结构的结构光,由于莫尔条纹效应,相当于在空间上对样本进行了调制。通过这种调制作用,人为给样本的空间信号加了一个载波,使激发出的荧光信号的频谱产生移动,进而让通常被滤除的高频信号能够最后被接收。最后通过特定的计算机算法将多张图像重组,可以得到最高将空间分辨率提升到原来两倍的图像,这就是结构光成像的基本原理。
图 1 结构光成像基本原理图解
以上过程的图解如图 1所示,其中图 1 (a) 是物体和照明光重合的效果,可以在重合区域看到一些竖着的比较粗的莫尔条纹,图 1 (b) 是传统显微镜系统的OTF区域,即系统带宽,图 1 (c) 是照明结构光的傅里叶变换,可以看到其有三个点(对应照明光的正弦分布),不过其仍然受系统衍射极限所限制,所以两侧的点仍然在OTF范围之内,在物体被结构光照明之后,虽然所探测到的图像仍然受到系统衍射极限的限制,但是由于莫尔条纹效应的存在,我们实际可以探测到信号所在频域如图 1 (d) 所示。在另外两个方向也重复上面的步骤,可以在各个方向均收集到OTF以外的信号,如图 1 (e) 所示,通过重建算法可以得到所有这些区域里的频率信号值,最后对该区域频率信号做傅里叶逆变换就可以得到一幅各个方向分辨率基本一致的的超分辨率图像。
参考文献
[1] Gustafsson, M. G. L. (2000). “Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.” Journal of Microscopy 198(2): 82-87.
参阅:莫尔条纹、荧光显微成像