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生物体和类似的透明、未染色标本的高分辨率光学显微镜通常缺乏对比度,使这些标本在明场照明模式下几乎不可见。使用显微镜物镜的全孔径,未染色标本的图像非常差,即使对于透明的周期性结构,如衍射光栅、排列纤维、集成电路复制品、丝状藻类和硅藻也是如此。
直到最近,荧光照明还是仅在配备专用高数值孔径物镜的研究级复合显微镜上可用的选项。随着基因编码和生物特异性荧光蛋白(如GFP(绿色荧光蛋白))的引入,立体显微镜对该技术的需求已经升级。
也许适用于所有形式的光学显微镜的观察最关键的方面是标本照明方法及其在揭示感兴趣特征方面的有效性。体视显微镜通常用于在反射(内窥)和透射(透射)照明方案下检查标本,采用各种光源和配置,这些光源和配置战略性地放置在适当的位置。
几乎透明和无色的标本可能几乎使用传统体视显微镜在体视显微镜中观察时不可见透射(透射)明场照明技术。这发生是因为微小样品细节衍射的光是四分之一波长异相,直射光通过当两者在中间图像平面中重新组合时,一个严重降低明场对比度的经典现象图像。
立体显微镜中的暗场观察需要一个包含反射镜和遮光板的专用支架,以倾斜的角度将倒置的空心照明锥引导到标本。暗场照明的主要元素对于体视显微镜和更传统的复合显微镜是相同的,后者通常配备复杂的多透镜聚光镜系统或具有专用内镜的聚光镜,其中包含面向特定几何形状的反射表面。
光学显微镜可以获得的最高可实现的点对点分辨率受一套基本物理定律的支配,这些定律无法通过物镜或孔径设计的合理交替轻松克服。这些分辨率限制通常被称为衍射势垒,它限制了光学仪器区分两个物体的能力,这两个物体之间的横向距离小于用于对标本成像的光波长的大约一半。
本交互式教程探讨了双折射各向异性晶体如何在光学显微镜中与偏振光相互作用。该试样是具有平行于晶体长轴的光轴取向的虚拟四方晶体。从偏振片进入晶体的光垂直于晶体的光学(长)轴传播。
阳光和几乎所有其他形式的自然和人工照明都会产生光波,其电场矢量在所有垂直于传播方向的平面上振动。如果通过用特殊材料过滤光束将电场矢量限制在单个平面上,则光被称为平面或相对于传播方向的线性偏振,并且在单个平面中振动的所有波称为平面平行或平面偏振。
双折射被正式定义为光在透明的分子有序材料中的双重折射,其表现为折射率存在方向依赖性差异。许多透明固体在光学上是各向同性的,这意味着整个晶格在所有方向上的折射率都是相等的。
偏振光是一种对比度增强技术,与其他技术(如暗场和明场照明、微分干涉对比、相衬、霍夫曼调制对比度和荧光)相比,它可以提高使用双折射材料获得的图像质量。偏振光显微镜具有高度的灵敏度,可用于针对各种各向异性标本的定量和定性研究。
显微镜中图像的形成依赖于两种关键光学现象之间的复杂相互作用:衍射和干涉。通过标本的光被标本中存在的微小细节和特征散射并衍射成发散波。标本散射的一些发散光被物镜捕获并聚焦到中间像平面上,叠加的光波通过干涉过程重新组合或求和,以产生标本的放大图像。
在切趾相衬显微镜中,可以通过利用位于后焦平面物镜内置物镜中的相片附近的选择性振幅滤波器来获得光晕衰减和样品对比度的增加。这些幅度滤波器由应用于相位膜周围相板的中性密度滤波薄膜组成,如教程窗口所示。
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