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相衬显微镜基本设计中最重要的参数是隔离从标本中出现的环绕光波和衍射光波,使它们在物镜后孔径的衍射平面中占据不同的位置。本交互式教程探索通过相衬显微镜的光路,并将入射电磁波剖析为环绕声 (S)、衍射 (D) 和合成(粒子;P) 组件。
为了产生最大的对比度效果,必须仔细对准相衬显微镜,而不会引入破坏标本外观或导致错误解释的伪影。本交互式教程探讨了当聚光镜环移入和移出与物镜中的相板对齐时,样品通过目镜(在不同放大倍率下)出现的变化。
根据位于物镜后焦平面中的相环的配置和特性,可以在正相衬或负相衬下观察样品。本交互式教程探讨了明场以及正负相衬显微镜中环绕声 (S)、衍射 (D) 和产生的粒子 (P) 波之间的关系。此外,还展示了相板几何形状和代表性样品图像。
在相衬图像中观察到的两个非常常见的效应是特征性阴影和光晕图案,其中观察到的强度不直接对应于样品与周围介质之间的光程差(折射率和厚度值)。本交互式教程演示了正相衬和负相衬显微镜中的阴影伪影。
相衬显微镜将样品光程长度的差异解释为光强度的波动,通过显微镜很容易观察到对比度的变化。本交互式教程探讨了折射率和厚度变化对表观整体光程长度的影响,并演示了两个试样如何具有这些变量的不同组合,但仍显示相同的光程长度。
相衬显微镜由荷兰物理学家Frits Zernike于1934年首次描述,是一种对比度增强光学技术,可用于产生透明标本的高对比度图像,例如活细胞(通常在培养物中),微生物,薄组织切片,光刻图案,纤维,乳胶分散体,玻璃碎片和亚细胞颗粒(包括细胞核和其他细胞器)。
相衬光学元件几乎可以添加到任何明场显微镜中,前提是专用物镜符合管长参数,并且聚光镜将接受正确尺寸的环形相环。主要制造商都为其研究和教学级显微镜提供正置和倒置(组织培养)配置的相衬配件。
生物体和类似的透明、未染色标本的高分辨率光学显微镜通常缺乏对比度,使这些标本在明场照明模式下几乎不可见。使用显微镜物镜的全孔径,未染色标本的图像非常差,即使对于透明的周期性结构,如衍射光栅、排列纤维、集成电路复制品、丝状藻类和硅藻也是如此。
活细胞中的各种细胞内成分和质膜之间的光吸收差异通常可以忽略不计,当使用经典的明场照明技术通过显微镜观察时,它们几乎不可见。相差显微镜利用细胞成分内以及未染色细胞与其周围水介质之间的微小折射率差异,在这些和类似的透明标本中产生对比度。
在共聚焦显微镜中,通过使用共聚焦针孔来抑制离焦背景荧光并产生薄(小于1微米)的未模糊光学切片,大大降低了这种限制。或者,反卷积显微镜采用传统显微镜使用光学系统的测量点扩散函数以数字方式重建图像。
生物光学显微镜的现代世界要求很高,日益复杂的研究应用需要能够跟上步伐的仪器。多年来,生物成像一直在利用越来越相关的生理系统进行实验,新技术使这种实验方法越来越可行。这些系统,包括整个模式生物、组织外植体和三维(3D)细胞培养物,必须以最小化扰动的方式进行成像,以保持其作为实验模型的生理完整性
现代荧光显微镜仪器采用干涉滤光片和二色分束器的组合,以满足用于标记标本的荧光探针的激发和发射要求。当适当选择这些成分时,显微镜为选择性激发样品荧光团以及随后分离图像形成所需的较弱荧光发射提供了基本机制。
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