系统简介
超维景自主研制的快速微型化双光子显微成像系统，在全球首次获取了小鼠在自由行为过程中大脑神经元和神经突触活动的清晰、稳定的动态图像。其产品具有高分辨、大视野等多个型号，可在动物自由活动状态下，约150 μm变焦和多平面快速切换的实时成像，并可对同一批神经元长期稳定跟踪。结合光遗传模块，还可以在结构与功能成像的同时，精准地操控神经元和大脑神经回路的活动。该系统为研究大脑的结构和功能提供了一个革命性的新工具，可融合微观神经元和神经突触活动与大脑整体的信息处理和个体行为信息，成为全景式解析脑连接图谱和功能动态图谱的利器。
系统特点和优势
探头优势
系统功能
小鼠（hSyn-GCaMP6s病毒注射）前额叶皮层神经元
小鼠（hSyn-GCaMP6s病毒注射）前额叶皮层神经元
小鼠（hSyn-GCaMP6s病毒注射）社交活动时前额叶皮层神经元
全神经标记斑马鱼（GFP标记神经，mCherry标记血管）
小鼠（hSyn-GCaMP6s病毒注射）前额叶皮层不同深度的神经元
系统配置参数
| 成像探头 | 高分辨型 重量：2.2 g 大小：9.5×15.5×17 mm3 分辨率：＜850 nm 成像视野：＞180×180 μm2 工作距离：＞390 μm 成像速度：9 Hz@512×512；18 Hz@256×256 |
大视场型 重量：2.8 g 大小：10×16×21 mm3 分辨率：＜1.3μm 成像视野：＞400×400 μm2 工作距离：1 mm 成像速度：9 Hz@512×512；18 Hz@256×256 |
| 三维变焦模块（可选配置） | 变焦范围：~ 30 μm，平面间切换速度：4 Hz | 变焦范围：~ 100 μm，平面间切换速度：4 Hz |
| 飞秒脉冲激光器 | 920 nm/1030 nm飞秒光纤激光器 平均功率：＞400 mW 重复频率：440-80MHz 脉冲宽度：＜200 fs |
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| 激光耦合模块 | 实现飞秒激光与激光传导光纤的有效耦合 | |
| 荧光采集模块 | 高灵敏度 GaAsP PMT 光谱接收范围：300~720 nm 绿色通道：520/50 nm（GCaMP6/GFP） 红色通道：605/50 nm（tdTomato） 可定制双通道 |
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| 成像控制模块 | 最大采样率：≥120MS/s 模拟输入分辨率：≥ 16-bits 模拟输入带宽：≥ 110 MHz |
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| 成像处理模块 | 成像工作站 屏幕：30英寸显示器 CPU内存：32G 显卡：2GB DDR5专业级显卡 硬盘：256G固态硬盘和2T机械硬盘 系统：win10操作系统 成像控制分析软件：GINKGO-MTPM |
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| 视场搜寻模块 | 便于宽场荧光与双光子成像切换 | |
| 一体式动物行为学成像工作台 | 可兼容大部分小鼠行为学实验，具有隔音、避光、紫外杀菌、耐腐蚀和耐磨损等多种特点 | |
| 系统尺寸 | 成像系统：955×1380×1825mm3 行为学工作台：1380×1380×2179mm3 |
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| 系统环境 | 温度：24 ± 2℃，建议使用可独立控制的空调系统 | |
| 湿度：＜60% | ||
微型化双光子显微成像系统包括八个基本组成部分：微型化双光子显微成像模块、飞秒脉冲激光器、激光耦合模块、荧光采集模块、成像控制模块、成像处理系统、宽场荧光显微镜、一体式动物行为学成像工作台。根据需要，还可以再配备三维电动变焦模块和光遗传模块等。
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1 微型化双光子显微镜 该模块是系统的核心技术模块，包括微型化双光子显微镜探头和激光传导光纤、荧光信号采集光纤和MEMS微机电扫描振镜线缆等耗材，如右图所示。 |
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探头经过特殊设计，高度集成了常规双光子显微镜的核心器件，可实现飞秒激光脉冲的无畸变传导、微小空间内的高速扫描/图像重建、高质量激光汇聚以及高效激发，成功获取了小鼠在自由行为过程中大脑神经元和神经突触活动的高分辨图像。 微型物镜数值孔径高达0.7，扫描视野范围大于260 μm x 200 μm，成像分辨率＜850 nm，可以清晰记录到亚微米量级的神经元树突棘活动，如图X所示。其成像质量与台式双光子显微镜相当，远优于宽场单光子荧光成像。同时，它具有盖玻片补偿以及更长的工作距离，可长时程观察样本，可观察更深层的组织。MEMS微机电扫描振镜具备多区域随机扫描和每秒5,000线的线扫描能力，成像帧频可达20 Hz （256×256像素），支持单/双向扫描模式。 |
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• 激光传导光纤 • 荧光信号采集光纤 • MEMS微机电扫描振镜线缆 |
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2 飞秒脉冲激光器
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自主研发的飞秒光纤激光器，有780 nm、920 nm以及1030 nm等波长。 •780 nm飞秒光纤激光器，用于激发蓝色荧光 •920 nm飞秒光纤激光器，用于激发绿色荧光 自行设计，采用了最新的光纤技术，结构紧凑。此激光器在较宽的调谐范围内可提供＜200 fs的脉冲，同时为双光子激发提供高峰强度。该波长可用于激发绿色荧光蛋白，在荧光成像领域有诸多应用。 •1030 nm飞秒光纤激光器，用于激发红色荧光 自行设计，采用了最新的光纤技术，结构紧凑。此激光器在较宽的调谐范围内可提供＜150 fs的脉冲。该波长可用于激发红色荧光蛋白，在荧光成像领域有诸多应用。 |
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3 激光耦合模块
可以实现激光光强的调节、激光shutter保护和耦合调节功能。
• 配有AOM声光调制器可进行快速光强调制，减少光漂白
• 飞秒激光可实现脉冲无畸变传导
• 带有激光快门保护
4 荧光采集模块
可实现不同荧光信号的采集和转化。模块采用高灵敏度GaAsP光电倍增管（PMT）探测微弱荧光信号。与雪崩探测器（APD）相比，它们的有源区域明显较大，非常适合捕捉由于散射或非线性光学效应而发散的信号，光谱接收范围为300~720 nm。此模块还集成有高速电流放大器（AMP）、PMT快门保护shutter及其驱动器、滤光片、MEMS扫描振镜驱动器等主要结构。
5 成像控制模块
该模块是整个成像系统的控制中心，包括MEMS驱动、信号发生模块、信号采集模块、信号处理和电源，对采集的电信号进行处理、还原、图像重建，以保证成像系统正常工作。其最大采样率≥120 MS/s，模拟输入分辨率≥16 bits，模拟输入带宽≥110 MHz。
6 成像处理模块
该模块是整个成像系统的显示终端和控制终端，并对图像进行处理和分析，包括电脑工作站和成像控制分析软件。通过该模块可以调整成像速度和激光功率、显示图像并进一步对图像进行分析和处理。
7 视场搜寻模块
在双光子活体成像前搜寻视野，用来快速定位最佳成像区域，提高实验效率。
8 一体式动物行为学成像平台
工作台具有隔音、避光、紫外杀菌、耐腐蚀和耐磨损等多种优点，确保行为学实验和成像效果。工作台可根据实验需求灵活搭配几十种行为学设备，如经典迷宫、条件恐惧、自身给药、睡眠剥夺、斯金纳等。
1 观察表达GFP的小鼠的神经元
小鼠大脑皮层的神经元表达Thy1-GFP，用微型化双光子显微系统和台式双光子显微镜进行观察，显示出几乎相同的对比度和分辨率，都可以清楚地观察到神经元的树突和树突棘（图1）。
图1 微型化和台式双光子观察Thy1-GFP小鼠的神经元成像
2 观察小鼠前额叶皮层树突和树突棘的钙活动
微型化双光子显微系统的功能成像性能与台式双光子相接近，能够实现目前广泛应用的指示神经元活动的荧光探针（如GCaMP6）的有效激发，灵敏捕捉钙信号（图2）。
图2 小鼠（GCaMP6病毒注射）前额叶皮层树突和树突棘活动
3 观察不同行为学实验下的小鼠大脑皮层的神经元钙活动
微型化双光子显微成像系统可以对自由行为动物进行稳定高分辨成像。当小鼠在进行多种行为学实验时，比如悬尾实验、跳台实验和社交行为，可实时监测小鼠大脑皮层的神经元活动（图3）。
图3 不同行为学实验下小鼠大脑皮层的神经元活动
4 观察处于不同平面的胞体和树突的钙活动，揭示深层的神经集群活动
解码神经网络整合需要同时检测树突的输入和胞体的输出。微型化双光子显微成像系统可在不同平面间快速切换，从而可观察主要位于软脑膜下方80微米的树突和软脑膜下方160微米的胞体。对树突和胞体的钙活动进行Pearson相关分析和网络分析，可将树突和胞体分为6个群。有趣的是，分属于不同群的树突和胞体在同一平面内部和不同平面之间相互交叉，并且每个群显示出平面特异的不同的空间分布模式（图4）。
图4：位于大脑皮层不同平面的树突和胞体及其功能分群
5 观察处于不同平面的神经元活动，将特定行为学相关的神经元进行分群分析
在小鼠行为学实验中，连续5天，我们观察了mPFC中深度为150微米和250微米的神经元，同时辅以行为学成像，结果发现受社会行为调控的ON和OFF神经元。根据行为学过程中其活动增强或者减弱将神经元进行分类，我们发现社会行为相关神经元的分群呈现高度动态变化：不仅ON神经元增多OFF神经元减少，而且两种神经元可以相互转换，甚至可以都转换成其它神经元。实际上，只有大约19%的ON神经元和24%的OFF神经元在连续两天的观察中保持分类不变（图5）。
图5：mPFC不同平面社会行为相关神经元的分类及其动态变化
6 观察不同行为状态下小鼠神经递质的释放
由乙酰胆碱介导的胆碱能信号参与了非常广泛的生理过程，包括肌肉收缩、心血管功能、神经可塑性、注意和记忆等。 作者开发了新型的可直接检测乙酰胆碱的基因工程探针，在此之前的方法均是间接检测。利用微型化双光子显微成像系统，作者评估了该探针测量小鼠自由运动时乙酰胆碱释放的效果。当小鼠跑步时，而不是受到视觉或听觉刺激时，乙酰胆碱释放增加，其释放量与跑步速度正相关，并具有时间和空间特异性（图6）。
图6 乙酰胆碱探针可直接检测自由运动小鼠乙酰胆碱的释放，并具有空间和时间特异性
发表文章
[1] Weijian Zong, Runlong Wu, Mingli Li, et al. Fast high-resolution miniature two-photon microscopy for brain imaging in freely behaving mice. Nat Methods, 2017, 14:713-719
[2] Miao Jing, Yuexuan Li, Jianzhi Zeng, et al. An optimized acetylcholine sensor for monitoring in vivo cholinergic activity. Nat Methods, 2020, 17:1139-1146
[3] Weijian Zong, Runlong Wu, Shiyuan Chen, et al. Miniature two-photon microscopy for enlarged field-of-view, multi-plane and long-term brain imaging. Nat Methods, 2021, 18:46-49
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