光学显微镜从1590年发明以来，不断发展，促进生命科学日新月异的发现，帮助人类逐层打开生命本质的大门。同时，生命科学的发展不断给光学显微镜提出新的要求，促使成像理论和技术持续更新迭代。
科学进入21世纪，人们已经不满足于在体外研究细胞和组织，需要能够更真实地探索生命，在体内实时观察细胞的发生和变化。此时，双光子显微镜进入了科学家的视野。
双光子显微镜的原理
在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收两个长波长的光子，然后发射出一个波长较短的光子，其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的（图1）。如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在单光子激发时，在波长为350 nm光的激发下发出450 nm荧光；而在双光子激发时，可采用750 nm的激发光得到450 nm荧光。
由于双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。这种激光器发出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，从而可以减少光漂白和光毒性带来的不利影响。
图 1 双光子吸收的原理
为什么活体成像需要双光子技术
在传统宽场显微镜中，来自标本不同纵深的光线都可投射到同一焦平面（感光元件）上，所以其成像是整个样品的重叠像，没有纵向分辨能力。单光子激光共聚焦显微镜用针孔有效滤除了杂散光，分辨率有了本质上的提高，拥有了对样品的特定焦平面精细成像的能力，可以进行三维成像、动态成像等。然而，针孔在滤除杂散光的同时也将大部分来自焦平面的荧光滤除了，仅有很弱的荧光到达检测器。若要提高信号强度，需要加大激发光功率，这又会导致对活细胞的光毒性和荧光分子的光漂白增加。双光子显微镜最大的优势来源于其双光子光源的非线性光学效应，与单光子共聚焦显微镜最大的不同在于无须使用针孔限制光学散射，其具体优势如下所述。
首先，双光子成像采用波长范围约在700~1000 nm的近红外光激发，在组织中的散射系数较小，穿透性很好，因此非常适合厚样本的观察。同时，由于是近红外光激发，也能避免样品中激发波长较短的自发荧光物质的干扰，可获得较强的荧光信号（图2）。所以双光子成像具有较深的穿透力和较小的光毒性。通常在活体脑组织中双光子显微镜有效成像深度可达200~500 μm，能够较好地进行三维成像。
图 2 血液及脑组织的吸收与散射光谱[1]
双光子成像的另一大优势在于精确的空间点聚焦性。一般条件下，物质只会被单光子激发，只有在光子密度足够高的情况下，物质才会吸收两个光子从而被激发，所以，双光子只会在光子密度最高的物镜焦点附近发生，很少产生焦平面外的杂散光（图3）。这种性质既提高了成像质量，也降低了样本的光漂白、光损伤区域。基于这些优势，使得双光子显微镜非常适合对活细胞、活组织进行长时间在体成像。
图 3 单光子与双光子激发荧光的对比
双光子显微镜的应用
由于适合动态活体成像，双光子显微镜一经问世便很快应用于神经科学、肿瘤免疫、遗传发育、药物代谢等领域。双光子显微镜能够在细胞甚至是亚细胞水平上对活体神经细胞的形态结构、离子浓度、细胞运动、分子相互作用等进行直接成像监测，而且能够进行光裂解、光激活、光转染和光损伤等光学操纵。同时，双光子显微镜能动态监测肿瘤在体内的生长和转移，并可对癌症治疗过程中癌细胞的变化进行实时观测和评估。随着光学技术、荧光探针技术、计算机成像技术的发展，双光子显微技术会得到更大提升和更广泛的应用，未来不仅用于基础研究，也将扩展到临床应用。
参考文献
[1] Susaki, Etsuo A. and Hiroki R. Ueda Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology, 2016. 23(1): p. 137-157.
